背景与目的脑出血(intracerebral hemorrhage,ICH)是最具破坏性的急性卒中类型,具有发病率、病死率以及致残率三高的特点,在我国约占脑血管疾病的20-30%,高居国民致死原因的榜首。其原因是ICH后脑损伤的机制不完全清楚,至今仍无特异有效的治疗手段。因此,深入研究ICH后脑损伤机制具有重要的临床意义。ICH引起的脑损伤包括原发性损伤和继发性损伤。ICH早期血肿机械压迫和占位效应对邻近脑组织的破坏损伤称为原发性损伤;随后由于血肿成分及其代谢产物引起的神经损伤称为继发性损伤。由于多个针对原发性脑损伤采取血肿清除术治疗的大型临床试验均未取得预期的临床效果,近年来ICH继发性脑损伤的机制及其防治成为关注的焦点。大量的研究表明,脑组织对血肿成分产生的免疫炎症应答导致的炎症损伤在ICH继发性脑损伤中具有关键作用,成为ICH继发性脑损伤机制研究的重中之重。ICH后脑内的小胶质细胞最先对血肿成分进行免疫应答,清除血肿、坏死细胞及其代谢成分的同时活化释放大量炎症因子,诱导炎症反应加剧导致脑损伤加重。仅有一部分研究显示抑制小胶质细胞活化能为ICH带来获益,其原因可能是抑制小胶质细胞活化的同时也抑制它的清理、修复功能。越来越多的证据显示,ICH后外周巨噬细胞和淋巴细胞向脑内浸润,释放促炎症因子,放大、加重ICH继发的炎症损伤。然而这些外周免疫细胞具体作用机制尚不清楚。辅助性T淋巴细胞Th17的细胞因子IL-17是强大的促炎症因子,被证实在实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)中可诱导神经炎症;巨噬细胞和树突状细胞的细胞因子IL-23可诱导CD4+细胞向Th17细胞分化,对IL-17的产生具有重要的调节作用。IL-23/IL-17轴参与了许多自身免疫性疾病的发生和发展。此外有研究显示,巨噬细胞分泌IL-23引起T淋巴细胞产生IL-17,在脑梗塞中具有关键性作用。提示IL-23/IL-17炎症轴在急性神经炎症中亦发挥作用。然而IL-23/IL-17炎症轴在ICH继发性神经炎症损伤中能否发挥作用尚不清楚。我们既往的研究发现,ICH后血肿成分Hb诱导小胶质细胞表面TLR2/TLR4异源二聚体形成,导致小胶质细胞活化,启动神经炎症发生。Hb能否诱导巨噬细胞表面TLR2/TLR4二聚体形成亦不清楚。因此在本研究中,我们应用小鼠自体血ICH模型,研究巨噬细胞和淋巴细胞及它们的细胞因子IL-23和IL-17在ICH继发性炎症损伤中的作用。在此基础上,利用离体及在体ICH模型,探讨了Hb诱导巨噬细胞表面TLR2/TLR4二聚体形成在ICH继发性炎症损伤中的作用。最后观察了中药提取物Ssn B破坏TLR2/TLR4二聚体形成对IL-23/IL-17炎症轴的阻断作用。我们的研究从外周免疫细胞参与ICH继发性炎症损伤的角度出发揭示ICH继发性炎症损伤的新机制,可望建立可行的免疫调控靶点,为脑出血免疫学治疗提供新途径。第一部分:外周巨噬细胞和T淋巴细胞参与脑出血继发性炎症损伤目的:明确外周巨噬细胞和T淋巴细胞在ICH后的数量变化及其在继发性炎症损伤中的作用方法:利用WT小鼠制备自体血ICH模型,流式细胞术(FACs)及免疫荧光染色检测血肿同侧大脑半球炎症细胞各亚型的数量变化情况。分别利用磷酸二钠脂质体(CLPs)删除小鼠体内巨噬细胞,芬戈莫德(Fingolimod)阻断淋巴细胞向小鼠脑内迁移,并利用Rag1-/-小鼠建立转移性过继模型,在此基础上制备小鼠自体血ICH模型,FACs检测血肿同侧大脑半球巨噬细胞、T淋巴细胞数量变化,同时检测小鼠脑水肿含量及神经功能缺损情况,明确巨噬细胞和T淋巴细胞在ICH继发性炎症损伤中发挥何种作用。结果:1、FACs结果显示血肿同侧大脑半球CD45+细胞(包括CD3+、CD4+、γδT细胞)绝对数显著增高,以ICH 4d最高;巨噬细胞绝对数显著增加,于ICH 1d达峰值;小胶质细胞数量无变化。免疫荧光染色发现,在血肿周围有大量F4/80+细胞和CD3+细胞。2、与WT小鼠相比,CLPs删除巨噬细胞的小鼠,ICH后血肿同侧大脑半球巨噬细胞数量显著减少,T淋巴细胞数量无明显变化,神经功能缺损评分较低、脑水肿减轻。3、与WT小鼠相比,Fingolimod处理的小鼠,ICH后血肿同侧大脑半球T淋巴细胞数量显著减少,巨噬细胞数量无明显变化,神经功能缺损评分较低、脑水肿减轻。4、与Rag1-/-小鼠相比,过继了WT小鼠CD3+细胞的Rag1-/-小鼠神经功能缺损评分较高、脑水肿加重。结论:ICH后血肿周围脑组织中巨噬细胞、T淋巴细胞数量增加。删除小鼠体内巨噬细胞后,ICH小鼠NDS评分减少、脑水肿含量下降,提示巨噬细胞浸润加重ICH继发性炎症损伤。阻断淋巴细胞向脑内浸润后,ICH小鼠NDS评分减少、脑水肿含量下降;过继了WT小鼠CD3+细胞的Rag1-/-小鼠ICH后NDS评分增加、脑水肿含量增加,提示外周T淋巴细胞浸润加重ICH继发性炎症损伤。第二部分:巨噬细胞分泌IL-23加重脑出血继发性炎症损伤目的:明确IL-23在ICH继发性炎症损伤中的作用并明确IL-23的来源方法:利用WT小鼠制备自体血ICH模型,WB和q PCR检测血肿周围脑组织IL-23蛋白及m RNA表达变化。利用WT、IL-23-/-小鼠分别制备自体血ICH模型,免疫荧光和TUNEL检测标记血肿周围脑组织凋亡神经元,q PCR检测血肿周围脑组织及炎症细胞中炎症因子的表达变化,同时进行小鼠神经功能缺损评分、检测脑水肿含量。结果:1、WB检测到ICH小鼠血肿周围脑组织IL-23蛋白表达增高,ICH 1d最高;q PCR结果与WB一致。2、与WT小鼠相比,IL-23-/-小鼠ICH后神经功能缺损评分降低、脑水肿减轻,血肿周围脑组织凋亡神经元数量减少,血肿同侧半球炎症细胞中IL-1β、TNFαm RNA表达降低。3、血肿同侧半球炎症细胞中IL-23m RNA的表达在ICH 1d最高;流式分选后使用q PCR检测发现IL-23m RNA仅在巨噬细胞中表达。结论:ICH后血肿周围脑组织IL-23蛋白及m RNA表达均增高,IL-23-/-小鼠ICH后神经功能缺损评分降低、脑水肿减轻,血肿周围脑组织凋亡神经元数量减少,血肿同侧半球炎症细胞中IL-1β、TNFαm RNA表达降低,提示IL-23参与并加重ICH继发性炎症损伤。ICH后血肿周围脑组织及血肿同侧半球炎症细胞中IL-23表达均在1d最高,与ICH后巨噬细胞数量达峰时间一致,提示巨噬细胞可能是IL-23的主要来源。流式分选后q PCR检测发现IL-23m RNA仅在巨噬细胞中表达,进一步明确了ICH后巨噬细胞是脑内IL-23的来源。第三部分:IL-23促进γδT细胞分泌IL-17加重ICH继发性炎症损伤目的:明确IL-17在ICH继发性炎症损伤中的作用及IL-17的来源,并证实IL-23对IL-17产生具有作用。方法:用WT小鼠制备自体血ICH模型,WB和q PCR检测血肿周围脑组织IL-17蛋白及m RNA表达变化。利用WT、IL-17-/-、γδCR-/-小鼠分别制备自体血ICH模型,免疫荧光及TUNEL检测血肿周围脑组织神经元凋亡,FACs检测血肿同侧大脑半球炎症细胞各亚型的数量变化,q PCR检测血肿周围脑组织及炎症细胞中炎症因子的表达变化,免疫荧光检测血肿周围CD3与IL-17的共标,同时评价小鼠神经功能缺损评分、脑水肿含量。结果:1、WB检测到ICH小鼠血肿周围脑组织IL-17蛋白表达增高,ICH 4d最高;q PCR结果与WB一致。2、与WT小鼠相比,IL-17-/-小鼠ICH后神经功能缺损评分降低、脑水肿减轻;血肿周围脑组织凋亡神经元数量减少;血肿同侧半球CD45+细胞(包括小胶质细胞、巨噬细胞、T淋巴细胞、中性粒细胞)数量无显著变化;血肿周围脑组织及血肿同侧半球炎症细胞中IL-1β、TNFαm RNA表达显著降低。3、FACs细胞内细胞因子染色检测发现WT小鼠ICH后血肿同侧大脑半球中IL-17+细胞数量4d最高;免疫荧光检测可见血肿周围组织CD3与IL-17共标;FACs检测IL-17+细胞表面标志物,发现所有IL-17+细胞均表达CD45,大部分表达CD3,几乎不表达CD11b;进一步将CD3+IL-17+细胞进行FACs检测,发现大部分IL-17+细胞是CD4-CR+;与WT小鼠相比,γδTCR-/-小鼠ICH后神经功能缺损评分降低、脑水肿减轻血肿同侧半球炎症细胞中IL-1β、TNFαm RNA表达降低。4、与WT小鼠相比,IL-23-/-小鼠血肿同侧半球IL-17+细胞百分比显著降低。结论:ICH后血肿周围脑组织IL-17蛋白及m RNA表达均增高,IL-17-/-小鼠ICH后神经功能缺损评分降低、脑水肿减轻,血肿周围脑组织凋亡神经元数量减少,血肿周围脑组织及血肿同侧半球炎症细胞中IL-1β、TNFαm RNA表达均降低,提示IL-17参与并加重ICH继发性脑损伤。ICH后血肿周围脑组织IL-17蛋白及m RNA表达在4d最高,血肿同侧半球炎症细胞中IL-17+细胞数量的表达也在ICH后4d最高,与ICH后T淋巴细胞数量达峰时间一致,提示T淋巴细胞可能是IL-17的主要来源,免疫荧光检测发现IL-17和CD3共标,FACs检测IL-17+细胞表面标志物,发现大部分IL-17+细胞表达CD3,均提示IL-17主要来CD3+T淋巴细胞。进一步流式分析后发现γδT细胞是IL-17的主要来源。IL-23-/-小鼠血肿同侧大脑半球IL-17+细胞百分比显著降低,提示IL-23对IL-17的生成具有关键作用。第四部分:Hb诱导巨噬细胞TLR2/4二聚体形成启动IL-23/IL-17炎症轴目的:证实Hb诱导巨噬细胞TLR2/4二聚体形成,及其在ICH继发性脑损伤中的作用方法:用WT小鼠制备自体血ICH模型,培养小鼠骨髓来源巨噬细胞(BMM),Hb刺激建立离体模型。免疫共沉淀(co-IP)检测ICH后巨噬细胞表面TLR2/4二聚体,免疫荧光多重标记检测F4/80、TLR2、TLR4共标。建立骨髓嵌合鼠,制备ICH模型,免疫荧光及TUNEL检测血肿周围脑组织神经元凋亡,同时评价小鼠神经功能缺损评分、脑水肿含量。q PCR检测不同基因型小鼠BMM受到Hb刺激后IL-23m RNA表达。Ssn B处理BMM及ICH小鼠,q PCR检测BMM及血肿周围脑组织IL-23、IL-17、IL-1β、TNFαm RNA表达变化,同时评价小鼠神经功能缺损评分、脑水肿含量。结果:1、免疫荧光多重标记检测血肿周围脑组织可见F4/80、TLR2、TLR4共标;co-IP检测发现ICH小鼠脑中分离的巨噬细胞有TLR2/4共沉淀,脾中分离的巨噬细胞无TLR2/4共沉淀;2、co-IP检测发现在血肿成分Hb,hemin,bilirubin,Fe2+,and Fe3+中,仅Hb可刺激的BMM有TLR2/4共沉淀;免疫荧光检测Hb刺激的BMM可见F4/80、TLR2、TLR4共标。3、与接受WT BMM移植的TLR2/TLR4双敲小鼠相比,接受TLR2/TLR4双敲BMM移植的WT小鼠ICH后神经功能缺损评分减低,脑水肿减轻,血肿周围凋亡神经元数量减少。4、Hb刺激不同基因型小鼠BMM后,q PCR检测发现TLR2或TLR4单独敲除组IL-23m RNA表达低于WT组,TLR2/TLR4双敲组低于单独敲除组,My D88敲除组几乎检测不到IL-23m RNA表达,TRIF敲除组与WT组相比无差异。5、Ssn B处理的BMM在接受Hb刺激后IL-23m RNA表达显著降低;ICH小鼠Ssn B处理后神经功能缺损评分减低,脑水肿减轻,血肿周围组织IL-23、IL-17 m RNA表达下降,血肿同侧半球炎细胞IL-1β、TNFαm RNA表达下降。结论:co-IP检测发现ICH小鼠脑中分离的巨噬细胞有TLR2/4共沉淀,脾中分离的巨噬细胞无TLR2/4共沉淀,提示ICH后浸润入脑内的巨噬细胞表面形成TLR2/4二聚体,外周巨噬细胞无TLR2/4二聚体形成,免疫荧光证实了这一结果。co-IP检测发现在血肿成分Hb,hemin,bilirubin,Fe2+,and Fe3+中,仅Hb的刺激BMM可见TLR2/4共沉淀,提示Hb诱导从而促进巨噬细胞活化产生IL-23,加重ICH继发性脑损伤。Ssn B能阻断TLR2/4二聚体形成,从而抑制IL-23、IL-17生成,减轻ICH继发性脑损伤。