背景及目的:　　乙型肝炎病毒（HBV）在感染患者体内持续复制，可以导致不同程度的肝内炎症，且与肝硬化和肝细胞癌的发生密切相关。HBV感染引起肝细胞内外环境发生改变，如细胞因子、应激分子等表达的变化参与炎症乃至肿瘤的发生与发展。HSP70s是应激蛋白超家族HSPs成员，其中HSPA5（GRP78）有分子伴侣作用，在应激状态下帮助需要折叠的蛋白质正确折叠。HSPA2在大多数组织中低表达，但在宫颈癌、膀胱癌等肿瘤组织中高表达，与肿瘤的发生发展相关。课题组前期研究证明细胞内HSPA2和HSPA5的过表达与其抗凋亡以及对化疗药物抵抗有关，低氧、HBV感染等可引起HSPA2、HSPA5表达发生变化，其表达变化的机制及其在肝癌中的作用尚不清楚。进一步研究发现HepG2和HBV稳定表达的肝癌细胞系HepG2.215细胞中microRNA的表达存在差异。据此推测在HBV感染过程中，HBV可能影响多种microRNA表达发生改变，通过作用于其靶蛋白，调节靶蛋白的表达，进而影响肝癌的发生发展。本课题在前期研究的基础上，进一步通过microRNA预测软件预测靶向HSPA5、HSPA2和抑癌分子PTEN的microRNA，采用荧光标探针法证明靶向作用HSPA2/5，抑癌分子PTEN的microRNA的表达，研究HBV感染对HSPA2/5，PTEN表达的影响，以及microRNA对HSPA2/5，PTEN表达的调控作用及其与肝癌的关系，为探索HBV感染对肝癌发展的影响提供新证据。　　方法:　　1. HBV感染及非感染病人肝脏组织中HSPA5、HSPA2、PTEN表达的检测　　免疫组化检测收集于华中科技大学同济医院肝外科病人手术切除标本，包括HBV感染肝癌、非HBV感染肝癌、肝血管瘤及正常肝组织中HSPA5、HSPA2和PTEN表达，Realtimie PCR检测组织中3种蛋白mRNA水平表达。　　2. LO2、HepG2、Huh7、HepG2.215细胞系中HSPA2、HSPA5、PTEN表达的检测　　Western blot检测LO2、HepG2、Huh7、HepG2.215细胞系中HSPA2、HSPA5、PTEN的总蛋白及上清表达，流式细胞术检测四种细胞系中HSPA2胞内及胞膜的表达。　　3. MicroRNA芯片，microRNA预测软件筛选相关microRNA，以及表达差异的检测　　MicroRNA预测软件预测 HSPA5、HSPA2相关 microRNA并与 HepG2、HepG2.215microRNA芯片结果对比，筛选出待测microRNA包括miR-181a、miR-362（预测靶向HSPA5）、miR-382、miR-19a（预测靶向HSPA2），同时选取另一肿瘤相关microRNA miR-140, miR-140的低表达与肝癌多结节、静脉受侵、包膜形成、分化等肝癌恶性化，以及肝癌整体及无病生存率降低相关性分析，并采用Taqman探针法realtimePCR检测其在HepG2、HepG2.215中的表达。　　4.转染microRNA模拟物检测相应蛋白表达的检查　　合成miR-181a、miR-362、miR-382、miR-19a mimics转染HepG2细胞，Taqman探针法realtimePCR检测microRNA表达，realtimePCR检测相应蛋白mRNA表达，western blot检测相应蛋白蛋白水平。　　5. MicroRNA靶基因验证-双荧光素酶报告基因检测　　为证实HSPA5为microRNA362靶基因、HSPA2为microRNA382靶基因，将预测靶基因的3’UTR构建至双荧光素酶质粒psi-check2荧光素酶编码区的下游，Dual-Luciferase Reporter Assay System检测HepG2细胞转染mimics及对应双荧光素酶质粒野生型和突变型，比较荧光差异。　　6.转染不同HBV相关质粒的HepG2细胞HSPA5、HSPA2、PTEN及miR-181a、miR-362、miR-382、miR-19a、miR-140表达的检查　　转染不同质粒的HepG2（pBlue-HBV、pCMV-HBe、pCMV-HBc、pCMV-HBx、pCMV-HBs、pCMV-HBs(M)、pCMV-Hbpres）检测HSPA5、HSPA2、PTEN及miR-181a、miR-362、miR-382、miR-19a、miR-140的表达。　　7.肝癌细胞增殖、迁移、侵袭实验　　CCK-8试剂盒检测HepG2细胞转染miR-181a、miR-362、miR-382、miR-19a mimics后细胞增殖的变化；划痕实验及Transwell检测细胞迁移改变；Transwell侵袭实验检测侵袭变化。　　8.肝组织HBVcccDNA检测　　采用QIAamp DNA Mini Kit试剂盒提取肝组织DNA，PASD（质粒保护DNA酶）处理DNA样本，探针法realtime PCR HBV cccDNA定量检测，根据校准品CT值与cccDNA浓度绘制标准曲线，计算待测样品的HBVcccDNA浓度。　　9. ELISA试剂盒检测细胞培养上清中HBsAg和HBeAg。　　使用ELISA试剂盒检测转染HBV质粒后HepG2细胞的培养上清，对比转染空载组的OD值，判断有无HBV病毒正常复制表达。　　结果:　　1. HBV感染及非感染病人肝脏组织中HSPA5、HSPA2、PTEN的表达　　采用real-time PCR和免疫组织化学方法分别检测肝脏组织中HSPA2、HSPA5及PTEN mRNA和蛋白表达，结果表明，在肝癌组织中HSPA2、HSPA5的表达高于癌旁组织。说明HSPA2和HSPA5表达变化与肝细胞癌变有关，而HSPA2在HBV阳性肝癌组织中表达低于HBV阴性组，其原因有待进一步研究。PTEN在癌旁组织的表达高于癌组织，且其表达随分化程度的降低而降低，肝血管瘤中表达为最高，提示PTEN的低表达可能与肿瘤细胞恶性变有关。PTEN在HBV阳性组低于HBV阴性组，说明在HBV感染中抑癌基因PTEN表达下调可能与肝癌发生发展有关。　　2.肝组织miR-140/181a/382/362/19a表达　　肝组织microRNAs的检测结果表明，miR-181a/382/362/19a在肝癌中的表达高于癌旁组织，其中miR-181a/382/19a在肝癌组织中的表达与肝癌病理分级有关，分化程度越低，表达量越高，说明miR-181a/382/362/19a的高表达与肝细胞癌变有关。miR-140在肝癌组织中的表达低于癌旁组织，提示miR-140的低表达与肝细胞恶性变有关。　　MiR-181a/382/362/19a在HBV阳性的肝癌组织中的表达高于HBV阴性组织，而其靶蛋白PTEN在HBV阳性组织中的表达低于阴性组织，提示HBV阳性的肝癌组织可能通过上调miR-181a/382/362/19a降低其靶蛋白PTEN在肝组织中的表达。　　3.细胞系LO2、HepG2、Huh7、HepG2.215中HSPA2、HSPA5、PTEN的表达　　在肝癌细胞系HepG2中HSPA2/5的表达高于正常肝细胞系LO2，但在稳转HBV的HepG2.215细胞系中却降低。PTEN于正常肝细胞系LO2中的表达为最高，同时HepG2.215低于HepG2，说明在HBV感染的情况下抑癌基因PTEN表达下调，可能在HBV感染所致肿瘤发生发展中其一定作用。　　4. LO2、HepG2、HepG2.215细胞microRNAs的表达　　从 HepG2和 HepG2.212细胞有表达差异的microRNA挑选miR-140/181a/382/362/19a作为候选分子，并合成其特异性Taqman探针，realtime PCR检测其在 LO2、HepG2、HepG2.215细胞中的表达差异，结果表明miR-181a/382/362/19a在HepG2细胞中的表达高于LO2细胞，HepG2.215中表达高于HepG2细胞；miR-140在HepG2.215细胞中表达最低，LO2细胞最高。　　5.不同microRNA对HSPA2、PTEN的靶向作用　　为了探讨HBV感染后HSP70s及PTEN变化机制，使用microRNA预测软件对HSPA2/5及PTEN进行预测，预测结果与microRNA芯片结果进行对比后筛选出待测microRNA，包括miR-181a、miR-362（预测靶向HSPA5）、miR-382、miR-19a（预测靶向HSPA2），将合成对应mimics转染HepG2细胞，结果显示miR181a、miR-362可调节HSPA5的表达，miR-382、miR-19a可调节HSPA2及PTEN的表达。　　将含靶基因HSPA53’UTR的双荧光素酶质粒与miR-362 mimics共转染HepG2细胞，HSPA2双荧光素酶质粒与miR-382 mimics共转染HepG2都可见荧光下调，证明HSPA5为miR-362靶基因，HSPA2为miR-382靶基因。　　6. HBV相关质粒转染对HSPA5、HSPA2、PTEN表达的影响　　使用jetPRIME试剂将HBV相关蛋白质粒转染入HepG2细胞，包括HBe、HBc、HBx、HBs、HBs、HBpres以及HBV质粒，培养72h后检测各组细胞，结果表明，HSPA5, HSPA2和PTEN的表达下调，转染HBs、pres组HSPA5、HSPA2和PTEN的表达下调，转染HBx质粒组PTEN的表达下调，提示HBV感染的肝细胞内HBs和HBpres的表达可下调HSPA5和HSPA2的表达，HBs、HBpres和HBx的表达可下调PTEN的表达。　　7. HBV相关质粒转染对miR-181a/362/382/19a、miR-140表达的影响　　转染HBV相关蛋白质粒后检测各组细胞内miR-181a/382/362/19a/140的表达，结果说明，HBs，HBx，HBpreS组miR-181a/382/362/19a的表达上调，miR-140的表达下调，说明HBV病毒感染肝细胞可通过HBs、HBx、HBpreS蛋白的表达调控miR-181a/382/362/19a/140的表达。　　8. MiR-181a/362/382/19a对肝癌细胞增殖、迁移及侵袭的影响　　使用转染试剂jetPRIME将miR-181a/362/382/19a mimics转染入HepG2细胞，CCK-8试剂盒检测细胞增殖情况发现miR-181a/362/382可促进肝癌细胞增殖，划痕实验和transwell迁移实验结果表明miR-181a/362/382可促进肝癌细胞迁移，说明miR-181a/362/382在HBV感染时在肝细胞中表达上调可促进肝癌细胞增殖迁移及侵袭的作用，而miR-19a表达虽然上调，却并不单独影响肝癌细胞的增殖迁移及侵袭。可以促进肝癌细胞增殖，迁移及侵袭，而miR-19a对肝癌细胞增殖，迁移及侵袭影响并不明显。　　结论:　　本课题研究证明：①在肝癌组织中HSPA2/5表达上调，抑癌基因PTEN表达下调，可能在HBV感染至肿瘤发生发展中起作用；②在HBV感染的肝癌细胞中多种microRNA的表达发生变化，其中miR-181a/382/19a在肝癌组织中的表达与肝癌病理分级有关，分化程度越低，表达量越高，说明miR-181a/382/362/19a的高表达与肝细胞癌变有关。miR-140在肝癌组织中的表达低于癌旁组织，提示miR-140的低表达与肝细胞恶性变有关。MiR-181a/382/362/19a在HBV阳性的肝癌组织中的表达高于HBV阴性组织，而其靶蛋白PTEN在HBV阳性组织中的表达低于阴性组织，提示HBV阳性的肝癌组织可能通过上调miR-181a/382/362/19a降低其靶蛋白PTEN在肝组织中的表达；③miR-181a/362/382可以促进肝癌细胞的增殖，迁移和侵袭。由此推测，在HBV感染的肝癌细胞中HBV通过其HBs, HBx等蛋白下调miR-140的表达，上调miR-181a/362/382/19a的表达，使其靶基因PTEN的表达显著降低，HSPA2/5的表达在HBV（+）肝癌组织均显著高于HBV（-）肝癌组织，提示HBV感染可通过microRNAs调控HSPA2/5和PTEN表达影响肝癌的发生发展。