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目的:癫痫是脑神经元过度放电而引起的反复发作性脑功能障碍,其中癫痫持续状态(SE)为一种严重的癫痫发作形式,严重影响着儿童发育和健康。在癫痫患者中约20％-25％的患者即使科学的应用抗癫痫药物,发作仍难控制,成为难治性癫痫,因此迫切需要寻求新的有效的治疗方法。研究表明神经干细胞(NSCs)移植的研究可为难治性癫痫的治疗带来一线曙光。NSCs增殖、迁移、分化、存活等演化过程是一个神经发生过程。成年大鼠的癫痫性发作等可导致NSCs的广泛增殖,由于发育鼠与成年鼠存在各方面的差异,用成年鼠的研究资料不能完全解释发育鼠的大脑癫痫后的反应机制。因此,本实验选择发育期大鼠观察SE后海马齿状回(dentate gyrus,DG)的神经发生特点,为神经干细胞移植治疗癫痫提供科学的参考依据。
方法:选择生后7天(P7)、P14、P21、P28四个日龄组SD大鼠,每个日龄组大鼠随机分为癫痫持续状态组(PTZ组)和正常对照组(NS组),戊四氮点燃SE后,通过免疫组化法观察发作后不同时间点的DG区细胞增殖情况。同时又选择P14大鼠为研究对象,通过标记5-溴脱氧尿核苷(Brdu)、NeuN、GFAP观察NSCs分化情况。
结果:1、点燃模型的建立及癫痫持续状态行为观察:PTZ组大鼠发作达3.5级以上,持续1小时,NS组无惊厥。2、NSCs增殖与迁移情况(nestin免疫组化):(1)在各个日龄鼠SE发作后第1天齿状回出现nestin阳性细胞,但是增加峰值的低于NS组,SE发作后第7天nestin阳性细胞逐渐增多,SE发作后第14天达到峰值,SE发作后第21天逐渐减少,第28天下降至最低。其中,SE发作后第7、14天幼鼠齿状回nestin阳性细胞数明显高于各自的NS组(P＜0.05),总体表现出先上升后下降的趋势。在各个日龄的相应正常发育鼠脑齿状回中nestin表达随着日龄的增加而逐渐减少。(2)在SE发作后同一时间点,齿状回内NSCs增殖强度具有明显的年龄相关性。在SE发作之后第1天nestin阳性细胞数随着大鼠日龄的增加而逐渐呈下降趋势,而且P7日龄大鼠与其他三个日龄组比较差异均有统计学意义(P＜0.05)。同样现象也存在于SE发作后第7、14、21天三个时间观察点。而对于正常发育鼠来说年龄越小nestin表达强度越大,年龄增大nestin表达减弱。(3)在SE发作后第1天及第7天时大部分nestin阳性细胞分布于颗粒下层,发作后第14天nestin阳性细胞逐渐向颗粒细胞层迁移,迁移时细胞形态发生改变。(4)在SE发作后第7天-第28天有少部分nestin阳性细胞异位迁移入海马的门区和内分子层,异位迁移现象在P14、P21、P28三个日龄组均可观察到,但在P7日龄组未见。(5)nestin阳性细胞不仅发现于齿状回,还存在于海马CA1、CA3及大脑皮层某些区域,如顶皮质区等。而且不同部位的细胞形态不同。3、NSCs分化情况(Brdu免疫荧光双标):Brdu阳性细胞大多同时表达成熟神经元的标记物(Noun),很少与星形胶质细胞标记物(GFAP)有共存现象。P14日龄大鼠不管在SE发作后还是正常发育中齿状回Brdu阳性细胞同时表达NeuN的细胞数均在80％以上,两组比较无统计学意义(P＞0.05),同时有4％-5％共表达GFAP,阴性对照组无免疫反应产物。
结论:1、癫痫持续状态可促进发育鼠海马DG的神经发生,而且神经发生有年龄相关性。2、NSCs增殖需经过数天的潜伏期,在癫痫发作后14天达高峰,并在3周-4周恢复正常。神经发生的最初部位在颗粒下层,约1周-2周NSCs迁移到颗粒细胞层,同时也有门区和内分子层异位迁移。NSCs最后大多分化为神经元。