海藻糖酶(Trehalase, TRE)是一种能够将海藻糖分解为两分子葡萄糖的酶,包括可溶性海藻糖酶(soluble trehalase,简称TRE1)和膜结合型海藻糖酶(membrane-bound trehalase,简称TRE2)两种类型。海藻糖酶抑制剂能够通过与海藻糖酶活性位点上的氨基酸相互结合形成复合物,竞争性地抑制海藻糖酶的活性从而影响昆虫体内的相关代谢途径。本文以褐飞虱(Nilaparvata lugens)为研究对象,选用效果较好的海藻糖酶抑制剂-Validamycin,研究海藻糖酶及其抑制剂在褐飞虱海藻糖和几丁质代谢中的调控功能。主要研究内容及结果如下：首先,利用RNAi技术研究了褐飞虱TRE基因对几丁质合成和降解通路中相关基因的调控作用,同时以注射dsGFP、dsTPS1和dsTPS2作为对照组。研究结果发现：单独TRE被抑制以及TRE同时被抑制48 h和72 h均会导致部分几丁质酶基因、几丁质合成酶基因CHS1及其两个不同可变转录子(CHS1a和CHS1b)和几丁质合成通路中其它关键基因的表达显著下降,同时TRE1-1、TRE1-2和TRE2调控的基因存在差异性。这些结果表明,TRE能够调控褐飞虱几丁质代谢途径中关键基因的表达,并且3个不同TRE在褐飞虱几丁质代谢调控作用也存在功能差异。此外,TPS1和TPS2被RNAi 48 h后CHS1、CHS1a、 CHS1b以及12个几丁质酶及复合体的表达显著下降；TPS1和TPS2被RNAi 72h后GFAT、GNNPNA、UAP、CHS1b以及7个或8个几丁质酶及复合体的表达也显著降低。结果表明褐飞虱体内海藻糖合成途径被干扰后,同样会抑制几丁质代谢途径中相关基因的表达。其次,我们对Validamycin注射浓度进行了初步筛选,根据筛选结果设置了0.1、0.5、1、5、10 μg/μL五个比较合理的浓度,通过对5龄褐飞虱若虫进行显微注射来抑制海藻糖酶活性,同时以注射过量的无菌水、过量的海藻糖和过量的葡萄糖作为对照,并于注射后48 h对抑制效果进行评价。结果表明,褐飞虱注射不同浓度的Validamycin 48 h后都表现出一定的死亡率和畸形率。褐飞虱死亡率和畸形率随着Validamycin注射浓度的增加而增加,在Validamycin注射浓度为10 μg/μL时死亡率和畸形率最高,分别为56.67%和37.78%。褐飞虱注射不同浓度Validamycin 48 h后,畸形形态主要有三种,分别为：蜕皮困难、翅型异常以及蜕皮困难且翅型异常。每种畸形表现的程度不同,其中蜕皮困难以及蜕皮困难且翅型异常所占的比例较大。再次,探究Validamycin注射48 h后对褐飞虱海藻糖代谢途径的影响。相关研究结果如下：可溶性和膜结合型海藻糖酶活性均显著降低,表明Validamycin能够有效地抑制褐飞虱海藻糖酶活性。海藻糖含量均显著升高,而葡萄糖和糖原的含量显著降低。研究结果还显示高于0.1 μg/μL的Validamycin注射褐飞虱后都能够有效地抑制海藻糖酶活性,而随着注射Validamycin浓度的增加,褐飞虱死亡率增加,表明较高浓度的Validamycin能够更加有效的控制害虫。最后,研究发现Validamycin能够直接通过调控几丁质代谢途径而导致褐飞虱的发育畸形及死亡。研究结果显示：褐飞虱注射Validamycin 48 h后,几丁质合成通路中的HK、G6PI、GFAT、GNPNA、PGM, UAP、CHS1(包括它的可变外显子基因,CHS1a和CHS1b)和7个几丁质酶的表达均显著低于对照组；几丁质的相对含量均显著下降,且几丁质相对含量随着Validamycin注射浓度的增加而减少。这些结果表明Validamycin主要通过抑制褐飞虱两种海藻糖酶活性进而调控其几丁质合成及降解,并导致其畸形和死亡。此外,在褐飞虱注射过量海藻糖和过量葡萄糖的对照组中,结果发现注射48 h同样出现一定的死亡率和畸形率。几丁质代谢通路中HK、GFAT、GNPNA、PGM、UAP、CHS以及9个或4个几丁质酶显著下调且几丁质含量也显著低于无菌水对照组,表明过量海藻糖和过量葡萄糖能够影响褐飞虱几丁质代谢。综上所述,海藻糖酶及其抑制剂(Validamycin)能够通过调控海藻糖代谢以及几丁质代谢通路中关键基因的表达,从而使褐飞虱几丁质含量降低,并导致蜕皮失败和翅型异常等畸形甚至死亡。