动脉粥样硬化(Atherosclerosis, AS)是一组称为动脉硬化的血管病中最常见、最重要的一种,可波及全身动脉血管,以大、中动脉最常见。冠状动脉粥样硬化性心脏病是动脉粥样硬化导致器官病变的最常见的类型,已经成为全世界致死率位居第一的疾病,远远超过恶性肿瘤对人类的威胁。因此如何有效抑制动脉粥样硬化的进展,预防冠心病的发生,已成为亟待解决的问题。目前通过Framingham研究及大型流行病学调查,已明确了其诸多冠心病危险因素,比如吸烟、肥胖、高血压、高血脂、年龄、糖尿病、静息生活方式,以及高尿酸血症、高同型半胱氨酸血症等。目前,生物钟紊乱对冠心病的影响越来越受重视。研究表明,生物钟周期异常可能直接影响心率、血压、激素水平、自主神经功能以及血液成分,导致多种心血管疾病,降低心脏功能,对健康产生重大危害。代谢综合征(Metabolic syndrome, MS)是一组以肥胖、高血糖、血脂异常以及高血玉等聚集发病的临床症候群,是多种心血管疾病(cardiovascular disease,CVD)的危险因素在同一个体聚集的病理状态。我国的研究结果显示,代谢综合征患者10年心血管病危险性较非代谢综合征增加了1.85倍。正常的生物钟节律对机体代谢的调节有重要的临床意义,而慢性的生物节律紊乱,比如倒班工作,与胰岛素抵抗、肥胖、代谢综合征和糖尿病等的高患病率密切相关。Bmall (brain and muscle Arnt-like protein)基因,又称为MOP3或ARNT3.是其中的一种生物钟子钟基因.是维持生物钟节律性振荡的关键基因。源于染色体免疫共沉淀测序分析,在小鼠肝脏中,时间解析的全基因组Bmall结合图显示碳氢化合物代谢是这一生物钟的主要输出。骨骼肌是胰岛素依赖的血糖处理的主要部位,但肌肉生物钟在调节糖摄入及代谢方面特殊的作用还无从知道。本研究即是通过小鼠骨骼肌特异性敲除Bmall研究其对肌肉本身及整体血糖及脂肪代谢的影响,从而在代谢方面探讨生物钟紊乱引发动脉粥样硬化的机制。研究表明,吸烟是心血管疾病的主要危险因子。据文献报道,吸烟20min即可损伤冠状动脉血管内皮,而冠状动脉粥样硬化病变的早期主要发生在冠状动脉的内皮细胞。但吸烟对血管内皮损伤的机制尚待进一步研究。受损的血管内皮细胞作为一个动脉粥样化形成的病灶,显示了细胞粘附分子比如ICAM一1和VCAM一1表达的增长。确切的证据表明在对于各种刺激的炎症反应中p38丝裂原活化蛋白激酶信号通路(p38MAPK)担负着一个关键的角色。然而p38MAPK信号通路在粘附分子在内皮细胞表面表达方面的影响还没有被探讨。本研究即是通过观察尼古丁对小鼠心脏血管内皮细胞ICAM一1和VCAM一1表达的影响,进一步明确吸烟对冠心病的致病机理,并探讨p38MAPK在细胞粘附分子表达中的作用。研究表明,吸烟可以影响HRV及皮质醇的分泌节律,这说明吸烟与主物钟节律有关,可以通过影响生物钟节律导致体内的一系列变化。吸烟亦与代谢综合征有密切关系。现有资料证明,p38MAPK参与了生物钟基因的表达及昼夜节律的输入和输出。由此可见,生物钟紊乱、吸烟和代谢综合征紧密相关,三者可能相互影响起到协同作用。而p38MAPK可能是其中的关键信号通路。因此,本研究在分别观察生物钟紊乱及吸烟导致动脉粥样硬化的致病机制的同时,进一步探讨两者之间的相互影响及内在联系,从而阐明其致病原因。第一部分骨骼肌内在生物钟Bmall缺乏对肌肉本身代谢的影响目的：观察骨骼肌选择性敲除Bmall对肌肉糖脂代谢的影响及相关基因及酶的改变,并进一步探讨其机制。方法：骨骼肌选择性敲除Bmall小鼠为观察对象,Bmal1-/-小鼠(B6.129一Arntl’m1Bra/J)由Jackson实验室提供,为实验组,记为KO组(MCK-Cre+/BMfl/fl),控制组为WT组(MCK-Cre-/BMfl/fl).KO组及WT组根据进食状态不同又分为禁食组(Fasting组),禁食后饲喂组(Refed组)。每组小鼠5-6只。均给予持续的12：12光照黑暗循环,光照开始时间于7：00a.m.,记为ZT0。8-12周龄的小鼠被用来研究。分离生长10周的WT组和KO组小鼠的后肢肌肉TA.Soleus和GN,肝脏,下丘脑,用qRT-PCR、免疫印迹法、组织免疫荧光法观察比较以下基因及蛋白的表达：1、生物钟基因Bmall.Rev-erbα;2、糖脂代谢相关基因MCAD、CPT-1b、LPL、FAS.Glut4、PDK4、分别从WT组和KO组生长4周的小鼠的后肢肌肉分离原代成肌细胞进行培养,用细胞免疫荧光染色及qRT-PCR观察比较两组间细胞分化情况及肌生成相关基因Mck、Myf5、Myogenin、MLC1、Myh3的表达。用核磁共振成像技术评估10司时两组间肌肉的质量。分离生长10周的WT组和KO组后肢肌肉TA、EDL,测定TA、EDL的脂肪酸氧化率和葡萄糖氧化率。分离生长10周的WT组和KO组后肢肌肉TA,行免疫组织化学荧光染色及免疫印迹,；匕较MyHC IIA和MyHC IIB勺表达情况。结果：KO组原代成肌细胞的分化、各成肌细胞相关基因的表达未受影响,总肌肉占体重百分比及单个肌肉占体重百分比未受影响。在正常小鼠中,禁食后饲喂状态下Glut4蛋白、Bmall蛋白在比目鱼肌及肝脏中表达明显增加；在禁食状态下,Rev-erba蛋白和PDK4蛋白在胫前肌及比目鱼肌表达增加。在禁食后饲喂状态下,KO组PDK4蛋白表达水平在TA和Soleus中均显著增加,Glut4蛋白表达水平在TA和Soleus中均显著减少；而在禁食状态下,PDK4和Glut4的蛋白表达水平两组间未见明显差异。qRT-PCR分析PDK4、MCAD、CPT-lb也表现出了同样的趋势(P<0.05)。KO组骨骼肌的葡萄糖氧化水平减低,而脂肪酸p-氧化水平增加(P<0.05)。应用qRT-PCR分析了两组在9AM(ZT2)和5PM(ZT10)时有关葡萄糖和脂肪酸代谢基因的在TA中的表达水平,结果显示与脂肪代谢有关的基因MCAD与CPT-lb在9AM时KO组表达明显增加,而PDK4在9AM及5PM时均明显增加。应用免疫组织化学及免疫印迹分析发现,KO组胫前肌(TA)中的肌纤维MyHC IIA曾加,而MyHC IIB减少。第二部分骨骼肌内在生物钟Bmall缺乏对全身代谢的影响目的：观察骨骼肌选择性敲除Bmall对机体整体糖脂代谢的影响,并进一步探讨肥胖形成的机制。方法：骨骼肌选择性敲除Bmall小鼠为观察对象,Bmall-/-小鼠(B6.129-ArntltmlBra/J)由Jackson实验室提供,为实验组,记为KO组(MCK-Cre+/BMfl/fl),控制组为WT组(MCK-Cre-/BMfl/fl)。KO组及WT组根据进食状态不同又分为禁食组(Fasting组),禁食后饲喂组(Refed组)。根据饮食类型KO组及WT组又分为普食饲养组(Chow)及高脂饲养组(HFD)。每组小鼠5-6只。均给予持续的12：12光照黑暗循环,光照开始时间于7：00a.m.,记为ZT0。8-12周龄的小鼠被用来研究。取WT组及KO组眼球后静脉血,比较两组在Refed:和Fasting状态下血清游离脂肪酸(FFA)、甘油(Glycerol)、甘油三酯(Triglyceride)糖(Glucose)、胆固醇(Cholestorel)水平。分离小鼠肝脏,包括Refed和Fasting组、Chow组和HFD组,行肝脏甘油三酯提取测定含量及油红O染色,比较在不同条件下WT组和KO组肝脏脂肪含量。比较WT组和KO组在Chow和HFD情况下体重的变化,观察4-12周。比较WT组和KO组在禁食0、12、24、36小时时体内脂肪含量的变化。用Comprehensive Lab Animal Monitoring System (CLAMS)则定两组的呼吸交换率、氧消耗量、总体活动水平。结果：结果显示在禁食状态下(Fasted), KO组循环中的游离脂肪酸(FFA)、甘油(Glycerol)和甘油三酯(Triglyceride)水平均明显降低,分别为P<0.01,P<0.05,P<0.01；而血糖水平显著升高,P<0.01。在禁食后饲喂状态下(Refed,4hrs)两组间以上指标无明显差异。KO组肝脏中的甘油三酯(Triglyceride)含量在禁食状态下明显减少,P<0.01。肝脏切片的油红O染色(oil-red-O staining)图像显示,在禁食状态下,WT组肝脏脂肪滴明显增多,而KO组肝脏脂肪滴明显较少。无论是普食饲喂组还是高脂饲喂组,在9AM时KO组肝脏中甘油三酯(TG)含量均明显减少(P<0.01),肝脏切片的油红O染色也显示出了同样的趋势。在高脂饲喂组,KO组在12周时体重明显减低,P<0.01；体脂含量在4周和12周时均表现出了明显减低,分别为P<0.05,P<0.01。发现在禁食12小时、24小时、36小时时KO组体脂的含量均明显少于WT组,分别为P<0.01,P<0.05,P<0.05。两组间呼吸交换率、每天的食物摄入量、每小时的氧消耗量、总体活动水平无明显差异。第三部分尼古丁经由p38 MAPK信号通路诱导ICAM-1和VCAM-1在小鼠心脏血管内皮细胞的表达目的：探讨吸烟对血管内皮细胞炎性标志物ICAM-1和VCAM-1的影响及p38 MAPK信号通路在其中的作用。方法：分离小鼠的心脏血管内皮细胞进行培养,第3至5代细胞被用来作为尼古丁暴露。用三种不同浓度的尼古丁进行处理,浓度分别为10-5,10-6和10-7M,实验证明当小鼠的心脏血管内皮细胞暴露在10-6M尼古丁的浓度下8个小时,ICAM-1和VCAM-1的活性达到了峰值。我们用10-6M浓度的尼古丁进行随后的实验。将培养的心脏血管内皮细胞分两组,一组用10-6M浓度的尼古丁处理细胞,另一组用10μM浓度的p38MAPK抑制剂(SB203580)预处理小鼠的心脏血管内皮细胞30分钟,然舌再用10-6M浓度的尼古丁处理细胞。处理后提取两组细胞的RNA及蛋白,用qPCR及免疫印迹法比较两组ICAM-1和VCAM-1的表达。结果：结果显示尼古丁通过p38丝裂原活化蛋白激酶信号通路增强了细胞粘附分子ICAM-1和VCAM-1在小鼠心脏血管内皮细胞的表达。结论：本研究发现肌肉Bmall的基因消融导致了代谢向脂肪氧化的方向转移,减少了肌肉对糖的摄取和利用,引发了胰岛素抵抗,缺少了正常状态下能量代谢在休息／空腹状态下以脂肪代谢为主向活动／饲喂状态下以糖代谢为主转变的这一正常的生理现象,并促使肌纤维的组成类型发生了相应的变化。肌肉中增强的脂肪氧化反过来阻止了肝脏中脂质的聚集而足进了脂肪组织中脂肪的动员。由于过量的甘油供应用于肝脏的糖异生而司时减少了肌肉中糖的利用,导致了循环中葡萄糖水平的升高而甘油三酯阳游离脂肪酸的水平降低,进而抑制了高脂饮食导致的肥胖。因此我们可以推断Bmall功能的增强可能会造成相反的结果,即胰岛素敏感性增加,从而导致了糖利用增加,抑制了脂肪酸p-氧化,而体内脂肪的过度积累造成了脂肪肝的形成及肥胖。本研究通过观察尼古丁对小鼠心脏血管内皮细胞ICAM-1和VCAM-1表达的影响,证明了10-6M的尼古丁在8小时时最大程度上增加了ICAM-1和VCAM-1在小鼠心脏血管内皮细胞的表达。我们的结果提供了一个推定的机制即尼古丁通过p38丝裂原活化蛋白激酶信号通路刺激了这些粘附分子的表达。综上所述,Bmall功能的缺失,将导致胰岛素抵抗,升高循环中血糖的水平,而Bmall功能的增强可能会抑制脂肪的氧化,导致循环中血脂水平增高及机体脂肪的蓄积,及无论Bmall的功能是减低还是增强,都可能导致机体糖脂代谢的异常,从而促进动脉粥样硬化的发生；而尼古丁通过p38MAPK信号通路刺激了心脏血管内皮细胞粘附分子表达的增加,从而促发了血管内皮细胞的炎症反应,导致了动脉粥样硬化。另外,我们推断生物钟紊乱、吸烟、代谢综合征之间可能存在某种联系。即吸烟在导致血管内皮细胞产生炎症反应的同时,会对机体的代谢产生影响。而生物钟紊乱在本研究中已证实对代谢产生了确切的影响。在本研究中证实吸烟可以通过p38MAPK信号通路产生不良反应,而既往研究证实p38MAPK信号通路可以对生物钟产生影响,所以吸烟可能通过p38MAPK信号通路影响生物钟的表达,进而影响机体的代谢。当然这还需要进一步的研究。