研究背景褪黑素是一种在哺乳动物和人体体内主要由松果体分泌的吲哚胺类激素,其在人体内有着促进睡眠、抗衰老、调节免疫、抗肿瘤等广泛的生物学作用。重金属元素镉(Cadmium),由于其在工业生产中广泛的应用及环境中的广泛的存在,在职业作业环境中常能引起职业暴露,引起职业人群的健康危害;同时,因为其可以在食物链内传递的特性,最后可以通过消化道或者呼吸道途径富集于人体,导致非职业人群的健康危害。镉离子在被机体摄入后,首先在血液中与白蛋白结合后,通过循环系统被运输到肝脏中。经过肝脏的解毒作用,镉离子可以少部分通过与谷胱甘肽(GSH)结合,经过胆汁排泄;但其大部分在肝脏内诱导金属硫蛋白(MT)生成,再与之相结合,透过肾小球基底膜,部分通过尿液排泄,更多的是蓄积在肾脏内,危害人体健康。因此肝脏是急性镉暴露造成机体损伤的公认的主要靶器官之一,但是其损伤机制目前尚未完全明确。线粒体是镉离子进入细胞后作用的主要靶器官之一,研究报道镉离子可以造成线粒体肿胀、活性氧生成水平增加、线粒体DNA突变几率增加和线粒体膜电位降低等损伤,最终会造成线粒体功能障碍。而已有许多报道称线粒体功能障碍是许多疾病的重要病因,因为我们猜测在镉急性暴露引起肝毒性中线粒体功能障碍同样起了重要作用。线粒体生成水平是影响线粒体功能状态的重要因素。PGC-1α(Peroxisome proliferator–activated receptorγcoactivator-1 alpha)是涉及到线粒体生成关键步骤中的重要因素,其上游信号分子SIRT1能够通过调节PGC-1α的乙酰化状态及活性水平来调节其在细胞内的功能状态,进一步影响线粒体生成及功能状态。有报道称褪黑素能够保护镉暴露所导致的肝毒性,除了作为抗氧化剂能够直接清除自由基外,其是否涉及到其他机制尚不明确。基于以上分析,本研究旨在以线粒体功能改变和线粒体生成为切入点,通过细胞水平的实验,明确镉暴露引起线粒体功能障碍和线粒体生成受损在镉的肝毒性中的作用;通过明确褪黑素对镉的肝毒性的保护作用及对SIRT1/PGC-1α信号通路和褪黑素受体1(Melatonin Receptor 1,MT1)的影响,揭示褪黑素对于镉的肝毒性的保护机制。研究内容①以Hep G2细胞为模型,通过建立含有不同浓度梯度的氯化镉(Cd Cl2)的培养基,构造镉暴露损伤模型,以细胞活力评估镉暴露对肝细胞的损伤作用;以活性氧生成和线粒体膜电位水平评估镉暴露对线粒体功能状态的影响;以线粒体dna拷贝数和线粒体质量评估镉暴露对线粒体生成的影响;②在上一步中建立的镉暴露模型基础上,加上褪黑素这种对线粒体功能有确切保护效应的化合物预处理,评价其在镉暴露中是否存在有保护作用;评估镉及褪黑素预处理对于sirt1及pgc-1α表达的影响,初步探讨褪黑素对镉暴露的保护机制;③在上一步中建立的镉暴露模型基础上,通过sirt1特异性抑制剂sirtinol及sirt1sirna对细胞内sirt1分子进行调控,进一步探讨褪黑素保护镉暴露所致肝毒性的是否通过sirt1/pgc-1α信号通路;通过加用褪黑素受体拮抗剂影响褪黑素受体功能,进一步探讨褪黑素的保护作用是否依赖于褪黑素受体机制。研究结果①浓度为2.5μm的镉暴露并不能对hepg2细胞的细胞活力、活性氧生成、线粒体膜电位水平、线粒体dna拷贝数及线粒体质量产生影响。但是5μm及10μm的镉暴露剂量即能对细胞活力、线粒体功能及线粒体生成产生毒性作用。②在5μm的镉暴露剂量下,加用0.5μm的褪黑素预处理两小时后,可以观察到hepg2细胞的细胞活力、活性氧生成、线粒体膜电位水平、线粒体dna拷贝数及线粒体质量较单纯镉暴露组有明显的上升。镉处理能够明显的抑制sirt1的表达,增加乙酰化pgc-1α的水平;而褪黑素预处理后镉暴露所导致的sirt1表达降低及乙酰化pgc-1α水平增加都有明显的抑制。③在上一步建立的褪黑素保护镉暴露模型上,加用sirt1特异性抑制剂sirtinol及sirt1sirna干扰hepg2细胞内sirt1的表达及活性后,褪黑素对于镉暴露干扰细胞活力、线粒体功能及线粒体生成的保护作用较单纯褪黑素预处理组有明显的下降,同时乙酰化pgc-1α水平也有所上升。在加用褪黑素受体拮抗剂luzindole以后,褪黑素对于因镉暴露所抑制的sirt1表达及增强的乙酰化pgc-1α的保护作用也有部分的下降。研究结论根据本课题的研究结果,我们可以获得以下结论:镉离子在进入细胞后引起的线粒体功能障碍及生成受损可能是其在急性暴露过程中造成肝毒性的重要原因。镉通过干扰线粒体的功能生成、影响线粒体的功能水平,影响肝细胞的生物学状态,从而表现出肝毒性效应;褪黑素可以通过促进细胞内mt1/sirt1/pgc-1α信号通路依赖性的线粒体生成水平,提高线粒体功能状态,进而保护镉暴露所致的肝毒性。本课题的研究进一步证实了镉暴露的肝毒性效应,并为以后临床工作中褪黑素被应用到急性镉暴露所导致的肝损伤的治疗中提供了一个新的分子学基础。