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目的:尽管血管紧张素Ⅱ已经被证明与心源性恶液质的发病机理有关,但是,血管紧张素Ⅱ引起肌肉萎缩的分子机制到目前为止还没有被发现。因为心源性恶液质病人体内的肿瘤坏死因子α（TNF-α）的含量都会升高,而且血管紧张素Ⅱ可以调节TNF-α的释放。另外,肌肉萎缩发生时一般都会伴随体内IGF-1信号通路的破坏。所以本课题主要研究TNF-α和IGF-1信号通路中的关键蛋白在血管紧张素Ⅱ诱导的肌肉萎缩中起到的作用。方法:我们使用C57BL/6小鼠和TNFR1敲除(TNFR1-/-)小鼠建立血管紧张素Ⅱ注入模型,来验证TNF-α是否能够介导血管紧张素Ⅱ诱导的肌肉萎缩。我们用Westernblot的方法检测了腓肠肌中与IGF-1信号通路相关蛋白的表达量;同时还检测了与泛素蛋白酶体途径及凋亡途径有关的蛋白的表达量。为了探索血管紧张素Ⅱ诱导肌肉萎缩的机制,我们用血管紧张素Ⅱ刺激成肌细胞C2C12,检测细胞中TNF-α的表达量的变化。我们还用TNF-α分别刺激培养在正常培养基和含有2%马血清培养基中的C2C12细胞,提取RNA进行基因芯片检测。为了确定TNF-α和Ch25h之间的关系,我们用过表达TNF-α质粒的慢病毒来转染C2C12细胞。然后,我们构建了过表达Ch25h基因的质粒,用来研究Ch25h过表达在肌肉萎缩过程中的作用。为了研究25-OHC以及它的两种结构类似物22-OHC和20-OHC是否能在动物体内诱导肌肉萎缩,我们将这三种成分腹腔注射到C57BL/6小鼠体内。然后用Western blotblot的方法检测IGF-1信号通路相关蛋白和caspase-3以及泛素蛋白酶体途径中的atrogin-1和MuRF1蛋白含量的变化。为了确认Ch25h在血管紧张素Ⅱ诱导的肌肉萎缩中的作用,我们将过表达25-羟化酶基因的慢病毒注射到C57BL/6小鼠胫骨前肌内,观察其是否会诱导肌肉萎缩。我们选取了一种GSK3β的抑制剂TDZD-8,来研究当GSK3β被激活时肌肉萎缩能否被抑制。将小鼠分为TDZD-8组和DMSO组及其相应注射血管紧张素Ⅱ组和对照组。每天秤取并记录小鼠体重,7天后,取小鼠肌肉并进行Western blot检测。结果:1、TNF-α信号通路可以介导血管紧张素Ⅱ诱导的肌肉萎缩。实验结果显示在血管紧张素Ⅱ注入模型中,C57BL/6小鼠的体重、抓力、肌肉重量、肌纤维横截面面积都会下降以及血浆中TNF-α含量的上升,但是在TNFR1-/-小鼠中,小鼠体重、抓力、肌肉重量、肌纤维横截面面积都不会下降。Western blot结果显示,在C57BL/6小鼠中,p-Akt和p-GSK3β蛋白含量会下降,在TNFR1-/-小鼠中这两种蛋白的含量没有变化。另外,我们还检测了两种泛素链接酶,atrogin-1和MuRF1的表达量,结果显示在C57BL/6小鼠中,这两种蛋白表达量升高,而在TNFR1-/-小鼠中,这两种蛋白含量没有变化。以上结果表明TNF-α可以介导血管紧张素Ⅱ诱导的p-Akt和p-GSK3β含量的下调以及可以通过TNFR1来介导血管紧张素Ⅱ诱导的泛素蛋白酶途径的激活。Cleaved caspase-3蛋白的含量在C57BL/6小鼠中上升,在TNFR1-/-小鼠中没有变化,表明TNF-α可以介导血管紧张素Ⅱ诱导的骨骼肌细胞凋亡。2、血管紧张素Ⅱ刺激成肌细胞C2C12之后,细胞内TNF-α的含量升高,MyoD的含量下降并且会抑制成肌细胞的分化。基因芯片结果显示,用TNF-α分别刺激培养在正常培养基和含有2%马血清培养基中的C2C12细胞之后,Ch25h基因分别上调35.6倍和22.2倍。C2C12细胞转染过表达TNF-α质粒的慢病毒之后,会使细胞内Ch25h的表达量明显升高,并且会抑制细胞的分化。C2C12细胞转染过表达Ch25h基因的质粒以后,细胞内Ch25h的表达量会上升,并且会抑制肌细胞的分化和MyoD的表达。此外,还会使atrogin-1和MuRF1的表达量上升。3、C57BL/6小鼠注射Ch25h的产物25-OHC会导致体重和肌肉重量的下降,然而注射22-OHC和20-OHC的小鼠体重和肌肉重量不会下降。Western blot结果显示注射25-OHC之后,p-Akt,p-GSK3β和p-Bad的表达量下降,cleaved caspase-3,atrogin-1和MuRF1的含量上升。而注射22-OHC和20-OHC则不会出现上述情况。小鼠胫骨前肌注射Ch25h过表达的慢病毒之后,结果显示Ch25h过表达可以通过抑制IGF-1信号通路及激活GSK3β诱导肌肉萎缩。4、C57BL/6小鼠分别注射GSK3β特异性抑制剂TDZD-8或DMSO之后,再分为血管紧张素Ⅱ组和对照组。7天后,注射血管紧张素Ⅱ和DMSO组小鼠体重和肌肉重量下降,其他组小鼠体重和肌肉重量没有变化。Western blot结果显示注射TDZD-8可以抑制血管紧张素Ⅱ引起的atrogin-1,MuRF1和cleaved caspase-3含量的升高。结论:血管紧张素Ⅱ注入野生型C57BL/6小鼠体内会导致肌肉萎缩,但是在TNFR1敲除的小鼠中则不会出现肌肉萎缩的现象,这就表明TNF-α可以通过它的1型受体介导血管紧张素Ⅱ诱导的肌肉萎缩。芯片分析结果确认了Ch25h是TNF-α的下游靶基因。C57BL/6小鼠腹腔注射Ch25h的产物,25-羟基胆固醇（25-OHC）可以导致肌肉萎缩,同时会使atrogin-1和Mu RF1的表达量的上升以及IGF-1/Akt信号通路的抑制GSK3β的激活。我们证明了25-OHC可以作为肌肉萎缩的一个诱发子,这就为肌肉萎缩的治疗策略提供了理论基础。