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目的:1、观察mt DNA对小鼠腹腔巨噬细胞PD-L1表达的影响;2、以UO126(MEK1/2通路抑制剂),SB203580(p38通路抑制剂),SN50(NF-k B通路抑制剂),LY294002(PI3K通路抑制剂)干预上述信号通路,筛选明显抑制PD-L1表达的细胞通路,并用氯喹(chloroquine,CQ)作用于经mt DNA刺激的巨噬细胞观察p38信号通路的变化,探讨巨噬细胞表达PD-L1的胞内信号传导通路;3、研究mt DNA诱导巨噬细胞对T细胞免疫活性的影响,并通过抗PD-L1单克隆抗体阻断PD-L1/PD-1信号分子改善其对T细胞功能的抑制。方法:采用体外实验研究。1.根据mt DNA浓度,分为3组:空白对照组;1ug/ml mt DNA组;10ug/ml mt DNA。分别加入PBS1ul;1ug/ml mt DNA和10ug/ml mt DNA,24小时提取各组,流式细胞术检测PD-L1表达。根据检测时间不同分为6组,每组均加入10ug/ml mt DNA,分别在0小时、6小时、12,小时、24小时、48小时、72小时提取各组,流式检测PD-L1表达。2.将巨噬细胞分为5组:10ug/ml mt DNA组;UO126组;SB203580组;SN50组;LY294002组。给予10ug/mlmt DNA;其余4组在给予10ug/ml mt DNA 1小时前分别给予信号传导抑制剂:20u M UO126(MEK1/2),10u MSB203580(p38MAPK),20u M SN50(NF-k B),25 u M LY294002(PI3K),培养24小时后对各组检测对象进行流式细胞术检测PD-L1表达。根据流式细胞术所得结果,用Western blotting细胞内信号通路检测:将巨噬细胞分为2组:10ug/ml mt DNA组;10ug/ml mt DNA+CQ组。给予mt DNA前30分钟加氯喹10 ug/ml,分别在0min、15min、30min、60min及120min提取各项检测对象进行Western blotting检测。3.10ug/ml mt DNA予小鼠腹腔巨噬细胞孵育24小时与磁珠分选(MACS)法得到的小鼠脾脏CD4+T细胞共培养。按巨噬细胞与CD4+T细胞1:10比例混合培养于96孔圆底板中,处理48小时后收集各组悬浮细胞,酶标仪在450nm处检测每个孔中的吸光度值[OD(450)];根据ELISA试剂中的说明,72小时后收集各组细胞上清液检测IFN-γ的含量。所有资料以均值士标准差表示,运用SPSS18.0软件检验,多组间的比较应选用单因素方差分析(one-way ANOVA),P<0.05时具有统计学差异。结果:1.流式细胞仪检测不同浓度mt DNA对小鼠腹腔巨噬细胞PD-L1分子表达情况:24h时后对照组、1ug/ml mt DNA组与10ug/ml mt DNA组在巨噬细胞表面PD-L1表达量随浓度增加而增加;10ug/ml mt DNA组随时间变化,表达量逐步升高,在给药6小时后开始迅速升高,于24小时~72小时维持高峰状态,72小时后缓慢下降,但仍处于较高水平,有统计学差异。2.SB203580组巨噬细胞PD-L1表达明显降低,mt DNA(10ug/m L)组细胞的P-P38、P38蛋白表达随时间逐高,加用氯喹组mt DNA刺激的巨噬细胞P-P38蛋白表达没有上调。表明mt DNA通过TLR9调节下游p38细胞信号通路。3.CD4+MΦ+mt DNA组和CD4+MΦ+mt DNA+anti-PD-L1组MTT OD值显著高于前两组,而且CD4+MΦ+mt DNA+anti-PD-L1组的增殖作用最明显,与CD4+MΦ+mt DNA组相比差异有统计学意义。加入a-PD-L1后,IFN-γ分泌水平明显较CD4+MΦ+mt DNA组和CD4+MΦ+mt DNA+Ig G1组高,且差异均有统计学意义。结论:1.mt DNA诱导巨噬细胞表达PD-L1,并成时间赖、浓度依性;2.mt DNA通过TLR-9-p38信号通路表达PD-L1;3.mt DNA通过PD-L1/PD-1信号分子抑制T细胞免疫活性,并经抗PD-L1单克隆抗体干预PD-L1/PD-1相互作用恢复T细胞功能,并诱导T细胞增殖,恢复细胞因子的产生。