植物的固着生长特性使其注定不能通过逃逸躲避胁迫,从而驱使其进化出复杂的调控网络以便原地应对周围环境的变化。植物生境高温难免,植物感知,并将高温信号传导至胞内,引起一系列基因的表达和蛋白质翻译,以适应高温。热激转录因子(Heat stress transcription factor,Hsf)和热激蛋白(Heat shock protein,Hsp)是高温信号传导通路中的两组关键蛋白。Hsp是一类热激响应蛋白,具有分子伴侣特性,能够保护靶蛋白免于高温的破坏,并参与靶蛋白的折叠、胞内分布及失活蛋白的降解。Hsf则通过调控热激响应基因的表达量来调节植物对高温胁迫的响应。目前,关于植物Hsf功能和机制的研究主要集中在模式植物拟南芥(Arabidopsis thaliana)、番茄(Solanum lycopersicum)和水稻(Oryza sativa),在大豆(Glycine max)和小麦(Triticum aestivum L.)等作物中尚缺乏系统研究。本文以大豆、小麦和拟南芥为研究材料,进行了Hsf基因家族分析、基因克隆、耐热功能验证和耐热机制研究,主要研究内容和结果如下:1.大豆Hsf基因家族成员鉴定分类、结构分析、表达分析、基因克隆、亚细胞定位和GmHsf-34基因的功能验证。(1)大豆Hsf基因家族成员鉴定分类:扫描数据库中大豆全基因组信息,获得候选Hsf家族成员,去除DNA结合域或寡聚域不完整的序列,最终鉴定出38个非冗余的Hsf家族成员;用大豆、拟南芥、水稻和玉米Hsf绘制系统进化树,分析大豆Hsf家族成员的进化关系,将其分为A、B和C三大类并进一步细分为12个亚类(A1、A2、A3、A4、A5、A6、A8、B1、B2、B3、B4及C1)。(2)大豆Hsf家族成员的基因和蛋白结构分析:大豆Hsf家族成员基因多数只有一个内含子,基因结构简单;启动子区含有多种顺式作用元件,可能参与多种胁迫响应;除A8和B4亚类,其他成员都具有核定位信号区,除A8亚类之外的A类成员都具有激活区。(3)大豆Hsf家族基因在不同组织、不同生长发育阶段、干旱和高温条件下的表达情况分析:分析基因芯片数据发现,不同组织器官相比,大豆Hsf基因在根中表达量最高,根中不同Hsf基因相比,GmHsf-34的表达量又最高;利用qRT-PCR技术分析了19个Hsf家族基因在干旱和高温胁迫下的表达情况,鉴定出10个同时受干旱和高温诱导的基因。(4)3个大豆Hsf家族基因克隆和亚细胞定位:从大豆cDNA中克隆了gmhsf-04、gmhsf-33和gmhsf-34三个a类hsf基因,经亚细胞定位分析,其编码的蛋白均定位于细胞核中。(5)gmhsf-34基因的耐热和抗旱功能验证:将编码a2亚类hsf的gmhsf-34基因转入拟南芥,发现gmhsf-34基因能够提高转基因拟南芥高温胁迫下的存活率和peg模拟干旱条件下的种子萌发率。说明gmhsf-34基因能够同时提高拟南芥的耐热和抗旱性。2.小麦tahsf1基因的功能验证和耐热机制研究。(1)tahsf1基因的耐热功能验证:将转tahsf1基因的拟南芥和野生型(wild-type,wt)拟南芥幼苗在高温(37°c)条件下进行长时间(48h)处理,发现tahsf1基因能够明显提高转基因拟南芥的存活率;将转基因和野生型拟南芥幼苗在37°c条件下处理42h,然后恢复正常条件培养至成熟,发现转基因拟南芥的株高和产量性状指标明显高于wt。上述结果表明,tahsf1基因能够提高拟南芥的耐热性。(2)tahsf1基因对拟南芥内源基因表达的影响:对转基因和wt拟南芥进行转录组测序分析,发现tahsf1基因促进erf(ethyleneresposivefactor)、nac(nam,ataf,andcuctranscriptionfactor)、mapkkk(mitogen-activatedproteinkinasekinasekinae)、细胞色素p450、水通道蛋白、晚期胚胎富集蛋白、过氧化物酶和硝酸盐转运体等家族基因的表达;利用荧光定量pcr(qrt-pcr)技术分析tahsf1基因对拟南芥耐热相关基因表达的影响,发现在高温条件下转基因拟南芥中一些hsp和hsf基因的表达量明显高于野生型拟南芥。(3)与tahsf1互作的hsp和hsf蛋白的筛选:将tahsf1基因连接到诱饵载体,利用酵母双杂交(yeasttwo-hybrid)技术从小麦cdna文库中筛选与tahsf1互作的蛋白,筛选出4个耐热相关且可能与tahsf1互作的蛋白,其中3个为热激蛋白(tahsp40、tahsp70和tahsp90),另一个为热激转录因子tahsfa2d。(4)tahsf1与tahsp40、tahsp70、tahsp90、tahsfa2d的互作验证:利用酵母双杂交、双分子荧光互补(bimolecularfluorescencecomplementation,bifc)和pull-down技术进一步证实了3个热激蛋白tahsp40、tahsp70、tahsp90和1个a2亚类热激转录因子tahsfa2d与tahsf1的互作关系。3.拟南芥athsfc1基因的功能验证和耐热机制研究。(1)athsfc1基因在非生物胁迫和激素处理条件下的表达情况分析:通过基因芯片数据分析和qrt-pcr验证,发现athsfc1基因的表达受干旱、高温、nacl和脱落酸(abscisicacid,aba)的影响。(2)athsfc1基因的耐热功能验证:将拟南芥athsfc1突变体(t-dna插入导致athsfc1基因功能丧失)和野生型幼苗在37°c条件下处理42h,发现athsfc1突变体拟南芥在高温条件下的存活率明显低于野生型;将拟南芥幼苗每天在30°c高温条件下处理6h直至成熟,发现athsfc1基因功能丧失导致拟南芥株高和产量性状指标明显降低。克隆正常AtHsfC1基因并连接到植物表达载体上,转化athsfc1突变体拟南芥,发现组成型表达的AtHsfC1基因能够将athsfc1突变体的耐热性恢复至野生型水平。上述结果表明,AtHsfC1基因功能的正常与否与拟南芥的耐热性密切相关。(3)AtHsfC1基因对拟南芥其他基因表达的影响:利用qRT-PCR技术分析AtHsfC1基因功能丧失对拟南芥耐热相关基因表达的影响,发现在高温条件下athsfc1突变体中一些Hsp和Hsf基因的表达量明显低于WT。(4)AtHsfC1和AtHsfA2的互作验证:鉴于小麦中C类和A类Hsf互作,而拟南芥AtHsfC1同样属于C类成员,于是进行了酵母双杂交分析,初步证实拟南芥AtHsfC1与AtHsfA2也存在互作,并利用双分子荧光互补和免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation,Co-IP)技术进行了进一步验证。本文的研究结果为利用基因工程技术改善农作物耐热性提供了一定的理论依据和候选基因资源。