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目的:构建ARK5基因干扰重组慢病毒载体,感染人胃癌AGS细胞株,检测ARK5基因沉默在人胃癌细胞中的表达情况。筛选出治疗人胃癌的基础性药物5-氟尿嘧啶,作用于人胃癌AGS细胞株,检测5-氟尿嘧啶对人胃癌细胞株的抑制作用效果。采用基因干扰技术和常用胃癌治疗药物相联合的实验设计思路,探讨ARK5基因沉默与5-氟尿嘧啶联合后对人胃癌AGS细胞的增殖、迁移、侵袭和细胞周期、细胞凋亡的恶性肿瘤生物学行为的影响。方法:1、设计针对ARK5基因的RNA干扰(RNA interference,RNAi)序列及相应的阴性对照(negative control,NC)序列并成功构建ARK5-RNAi重组慢病毒载体;2、用阴性对照的慢病毒载体(带有GFP标签)感染人胃癌AGS细胞,使用荧光倒置显微镜观察并拍照,应用图文分析软件检测该慢病毒载体感染人胃癌AGS细胞的最佳条件;3、蛋白免疫印迹实验检测慢病毒载体对靶基因ARK5的沉默效果;4、MTT比色法检测给予目的基因(ARK5)RNA干扰及联合经典胃癌化疗药物5-FU对人胃癌AGS细胞增殖的抑制作用,以确定最明显的药物浓度;5、基于以上实验研究结果,实验设计分为六组:正常对照组(Control group)、阴性对照组(NC group)、慢病毒感染组(ARK5-RNAi group);正常对照+5-FU组(Control+5-FU group)、阴性对照+5-FU组(NC+5-FU group)、慢病毒感染+5-FU组(ARK5-RNAi+5-FU group)。(1)采用划痕愈伤实验模型检测人胃癌AGS细胞的迁移能力;(2)采用Transwell侵袭实验检测人胃癌AGS细胞的侵袭能力;(3)采用流式细胞术检测人胃癌细胞AGS的细胞周期阻滞情况;(4)采用流式细胞术检测人胃癌细胞AGS的细胞凋亡变化情况;以上每组实验重复6次。结果:1、预实验结果:ARK5基因沉默的慢病毒感染的最佳条件是,感染复数MOI值为100,感染体系为含有10%FBS的1640低糖培养基+Polybrene;2、免疫印迹结果显示:ARK5-RNAi慢病毒表达载体能明显降低人胃癌AGS细胞中ARK5蛋白的表达,与未转染组比较具有显著性差异(p<0.01);3、MTT显色法检测结果表明:人胃癌AGS细胞生长抑制率在一定药物浓度范围内,随着5-FU浓度的增加,细胞增殖抑制率不断增大;ARK5基因沉默与5-FU药物单因素处理人胃癌AGS细胞,均能一定程度地抑制胃癌细胞的体外增殖;ARK5基因沉默联合5-FU药物作用,对人胃癌AGS细胞的细胞增殖抑制作用更为显著,药物浓度为80ug/ml时,联合抑制人胃癌AGS细胞的体外增殖能力最大,同时,药物浓度>80ug/ml时,联合抑制人胃癌AGS细胞的体外增殖效果不佳;4、划痕实验结果显示:人胃癌AGS细胞株经过ARK5基因沉默后,Control组与NC组相比细胞体外迁移能力无明显变化,ARK5-RNAi组、5-FU组与Control组相比细胞体外迁移能力明显降低;ARK5基因沉默联合5-FU药物作用,即ARK5-RNAi+5-FU组对肿瘤细胞体外迁移抑制作用较单独给予ARK5基因沉默或5-FU处理更为显著,以上结果均具有显著的统计学意义(P<0.01);5、Transwell侵袭实验检测结果显示:人胃癌AGS细胞株在ARK5基因沉默感染下,Control组与NC组相比细胞的侵袭能力无明显变化,ARK5-RNAi组、5-FU组与Control组、NC组相比细胞的侵袭能力明显降低;同时,ARK5基因沉默联合5-FU药物作用,即ARK5-RNAi+5-FU组对肿瘤细胞的侵袭能力较单独给予ARK5基因沉默或5-FU处理更为明显,以上结果均具有显著的统计学意义(P<0.01);6、流式细胞术检测结果显示:ARK5基因沉默促进了人胃癌AGS细胞株的凋亡和阻滞了人胃癌细胞周期,结果均具有显著的统计学意义(p<0.01);ARK5基因沉默联合5-氟尿嘧啶作用于人胃癌AGS细胞株后,单独给予ARK5基因沉默或5-FU处理,细胞凋亡率更高和细胞周期阻滞更强,其差异具有统计学意义(p<0.01)。结论:ARK5基因沉默与5-氟尿嘧啶药物联合应用,对人胃癌AGS细胞系的恶性肿瘤行为较单一给予ARK5基因沉默或5-氟尿嘧啶的干预措施具有更为显著的效果,表现为显著抑制胃癌细胞系的增殖、迁移和侵袭,显著阻滞细胞周期,明显促进细胞的凋亡,揭示ARK5基因沉默与5-氟尿嘧啶药物联合作用对人胃癌AGS细胞系的恶性肿瘤生物学行为具有协同抑制效应。