背景造血干细胞是机体中能够进行自我更新和具有多向分化潜能的成体干细胞。造血干细胞移植可以在受者体内重建新的功能性造血系统,在临床上用于治疗血液系统恶性疾病以及其他恶性肿瘤,并用于基因治疗。造血干细胞的主要来源包括骨髓、动员外周血和脐带血。移植中回输造血干细胞的数量与成功植入和患者存活率相关。目前认为同种异体移植物中CD34⁺细胞数量≥2×10⁶个/kg,自体移植物中CD34⁺细胞数量≥5×10⁶个/kg,可以获得快速并持续的植入。造血干细胞移植作为重要的临床治疗手段得到了广泛的应用,然而不论是何种来源的造血干细胞,其数量都非常有限。脐带血中造血干细胞的数量相对较少,因此脐带血移植主要用于儿童患者,成年患者经脐带血移植后常常导致嗜中性粒细胞和血小板植入延迟,容易增加感染的风险。动员外周血造血干细胞采集便利,使供者免于骨髓穿刺和麻醉,但传统动员外周血方案的失败率较高。普乐沙福作为新一代的动员药物,可以挽救部分动员不佳或动员失败的患者,但对体内造血干细胞和骨髓微环境严重受损的患者仍然无法改善其动员结果。综上所述,造血干细胞数量不足是制约造血干细胞应用的关键问题之一。因此,体外有效扩增造血干细胞成为解决该问题的重要手段。高通量筛选小分子化合物文库发现嘧啶吲哚衍生物UM171和嘌呤衍生物SR1可以实现脐带血造血干细胞体外有效扩增,正在进行的临床试验得出了安全有效的初步结果,但其对不同来源造血干细胞的扩增作用及分子机制仍不明确。目的本研究旨在探讨小分子化合物UM171和SR1对人脐带血、供者动员外周血以及淋巴瘤患者自体动员外周血来源的造血干/祖细胞的体外扩增、多谱系分化能力以及造血干/祖细胞表面CXCR4表达的影响;探索淋巴瘤患者自体动员外周血造血干/祖细胞体外有效扩增的条件,为临床治疗动员不佳或动员失败的淋巴瘤患者提供挽救措施,并进一步探索小分子化合物作用于造血干/祖细胞的分子机制。方法1.获取脐带血、供者动员外周血和淋巴瘤患者自体动员外周血,通过人外周血淋巴细胞分离液和磁性细胞分选技术富集三种来源的CD34⁺细胞,以分选出的细胞作为未培养组。使用添加100 ng/m L SCF、100 ng/m L Flt-3L、100 ng/m L TPO、100 ng/m L IL-6的Stem Span ^TM SFEMⅡ组成的造血干细胞扩增培养基进行体外扩增培养。将三种来源的CD34⁺细胞分别分为对照组、UM171组、SR1组和UM171+SR1组在体外培养10天。通过流式细胞术和细胞计数检测CD34⁺细胞、CD34⁺CD38^-细胞、CD34⁺CD38^-CD45RA^-CD90⁺细胞的比例和绝对数量,由各体外培养组细胞数除以接种细胞数计算得出扩增倍数。2.收集对照组、UM171组、SR1组和UM171+SR1组三种来源体外培养10天后的细胞,通过集落形成实验和流式细胞术检测体外扩增后细胞的多谱系分化能力。3.三种来源的CD34⁺细胞经对照组、UM171组、SR1组和UM171+SR1组体外培养48小时,通过流式细胞术检测CD34⁺细胞、CD34⁺CD38^-细胞和CD34⁺CD38^-CD90⁺细胞上CXCR4的表达水平。4.根据动员结果的不同,将淋巴瘤患者分为动员不佳组（CD34⁺细胞采集量<2×10⁶个/kg）和动员达标组（CD34⁺细胞采集量≥2×10⁶个/kg）,将2组患者CD34⁺细胞添加UM171在体外培养10天,通过流式细胞术和细胞计数检测CD34⁺细胞、CD34⁺CD38^-细胞、CD34⁺CD38^-CD45RA^-CD90⁺细胞的比例和绝对数量,并计算扩增倍数。5.淋巴瘤患者自体动员外周血CD34⁺细胞经对照组和UM171组体外培养10天,收集细胞,提取RNA进行转录组测序,寻找差异表达基因并进行基因本体论富集分析,探索UM171促进淋巴瘤患者自体动员外周血造血干/祖细胞扩增的分子机制。结果1.脐带血来源的CD34⁺细胞经体外培养10天后,与对照组比较,UM171组、SR1组和UM171+SR1组CD34⁺细胞与CD34⁺CD38^-细胞比例均升高,UM171+SR1组CD34⁺细胞与CD34⁺CD38^-CD45RA^-CD90⁺细胞的扩增倍数均升高（P均<0.05）;总有核细胞的扩增倍数在各组之间的差异无统计学意义（P>0.05）。供者动员外周血来源的CD34⁺细胞经体外培养10天后,与对照组比较,UM171组、SR1组和UM171+SR1组CD34⁺细胞与CD34⁺CD38^-细胞比例均升高,UM171组和UM171+SR1组CD34⁺CD38^-CD45RA^-CD90⁺细胞比例均升高,UM171组CD34⁺CD38^-细胞与CD34⁺CD38^-CD45RA^-CD90⁺细胞的扩增倍数均升高,UM171+SR1组CD34⁺CD38^-CD45RA^-CD90⁺细胞的扩增倍数升高（P均<0.05）;总有核细胞的扩增倍数在各组之间的差异无统计学意义（P>0.05）。淋巴瘤患者自体动员外周血来源的CD34⁺细胞经体外培养10天后,与对照组比较,UM171组CD34⁺CD38^-细胞与CD34⁺CD38^-CD45RA^-CD90⁺细胞比例均升高,UM171+SR1组CD34⁺细胞与CD34⁺CD38^-CD45RA^-CD90⁺细胞比例均升高,UM171组CD34⁺细胞、CD34⁺CD38^-细胞与CD34⁺CD38^-CD45RA^-CD90⁺细胞的扩增倍数均升高,UM171+SR1组CD34⁺细胞的扩增倍数升高（P均<0.05）;总有核细胞的扩增倍数在各组之间的差异无统计学意义（P>0.05）。2.集落形成实验结果显示,同一来源形成的粒细胞集落（CFU-G）、巨噬细胞集落（CFU-M）、粒髓系细胞混合集落（CFU-GM）、红系细胞集落（CFU-E、BFU-E）和多系细胞混合集落（CFU-GEMM）的数目在各组之间的差异均无统计学意义（P均>0.05）。流式检测结果显示,与对照组比较,UM171扩增后脐带血来源的CD33⁺（髓系）细胞比例升高,CD41⁺（巨核）细胞比例降低（P均<0.05）;SR1扩增后三种来源的CD3^-CD56⁺（自然杀伤）细胞比例均升高（P均<0.05）。3.三种来源的CD34⁺细胞经体外培养48小时后,与未培养组比较,对照组、UM171组、SR1组和UM171+SR1组CD34⁺细胞、CD34⁺CD38^-细胞与CD34⁺CD38^-CD90⁺细胞上CXCR4的表达水平均升高,差异具有统计学意义（P均<0.05）。但与对照组比较,UM171组、SR1组和UM171+SR1组CD34⁺细胞、CD34⁺CD38^-细胞和CD34⁺CD38^-CD90⁺细胞上CXCR4表达水平的差异均无统计学意义（P均>0.05）。4.动员不佳组自体动员外周血来源的CD34⁺细胞经UM171体外培养10天后,CD34⁺细胞、CD34⁺CD38^-细胞和CD34⁺CD38^-CD45RA^-CD90⁺细胞的比例以及总有核细胞、CD34⁺细胞、CD34⁺CD38^-细胞和CD34⁺CD38^-CD45RA^-CD90⁺细胞的扩增倍数与动员达标组的差异均无统计学意义（P均>0.05）。5.分析转录组测序结果得知,与对照组比较,UM171组扩增的淋巴瘤患者自体动员外周血造血干/祖细胞鉴定出1,287个差异表达基因,包括840个上调基因和447个下调基因。上调的基因主要包括造血干细胞、肥大细胞和内皮细胞特异性基因以及调控肿瘤细胞增殖和分化的基因等,下调的基因主要包括巨核细胞和红细胞相关基因、趋化因子和细胞粘附相关基因以及转录因子相关基因等。基因本体论富集分析表明,这些差异表达基因主要集中在调节细胞粘附分子活性和趋化因子活性、细胞表面多种受体与配体结合、细胞表面通道蛋白和转运蛋白活性等分子功能,并调控了非经典Wnt信号通路、细胞对活性氧的应答、干细胞增殖、细胞分化和外源性凋亡信号通路,以及肿瘤坏死因子超家族细胞因子的产生、对转化生长因子β的应答等生物过程。结论1.小分子化合物UM171和SR1体外培养人脐带血、供者动员外周血和淋巴瘤患者自体动员外周血三种来源的造血干/祖细胞,均能够促进造血干/祖细胞比例的升高,UM171能够有效扩增三种来源造血干/祖细胞的数量。2.小分子化合物UM171和SR1体外扩增三种来源造血干/祖细胞的同时均能保持其多谱系分化的潜能。UM171促进脐带血来源造血干/祖细胞分化为髓系细胞并抑制其分化为巨核细胞。SR1促进三种来源造血干/祖细胞分化为自然杀伤细胞。提示SR1可能是参与诱导自然杀伤细胞产生的有效小分子化合物。3.小分子化合物UM171和SR1不影响三种来源造血干/祖细胞上归巢相关因子CXCR4的表达,但本研究所用的体外扩增培养体系使三种来源造血干/祖细胞上CXCR4的表达水平显著升高,有助于促进造血干/祖细胞归巢和长期植入。4.小分子化合物UM171能够促进动员不佳淋巴瘤患者自体动员外周血造血干/祖细胞的比例升高并有效扩增其数量,UM171扩增动员不佳淋巴瘤患者和动员达标淋巴瘤患者的自体动员外周血造血干/祖细胞的作用无显著差别。为动员不佳和动员失败的淋巴瘤患者提供了接受自体干细胞移植的机会。5.机制研究表明,小分子化合物UM171促进淋巴瘤患者自体动员外周血造血干/祖细胞扩增的机制与抑制红细胞和巨核细胞分化,激活非经典Wnt信号通路,细胞内活性氧水平的调控以及促炎和抗炎/解毒网络之间的平衡有关,转化生长因子β和肿瘤坏死因子等细胞因子也起到重要作用。此外,本研究鉴定出肥大细胞和内皮细胞特异性基因表达增加与造血干/祖细胞的扩增或自我更新有关,值得进一步研究。