水稻是重要的粮食作物,全球50%人口以其为主食。水稻产量是水稻生产的重要指标,杂种优势是水稻产量提升的理论基础之一。雄性不育的利用是杂种优势实现的最优途径。尽管已有非常多的雄性不育基因被报道,但能适用于杂种优势利用的基因并不多,而且水稻雄性不育机理尚未完全阐明。本研究利用明恢63中发现的一个自然突变产生的无花粉型雄性不育突变体osnp2（Oryza sativa L.no pollen 2）,先通过半薄切片、扫描电镜等详细研究osnp2的败育特征,然后通过分子标记,结合改进的MutMap方法,对OsNP2进行图位克隆,确定候选基因。其后利用CRISPR/Cas9对候选基因进行敲除验证,并利用RT-qPCR进行OsNP2的表达模式分析。其具体结果如下:1.osnp2突变体败育特征与野生型明恢63相比,osnp2的穗型和颖花外形无明显变化,颖花结构完整,花药细小,能正常伸出,颜色无明显差异,无成熟花粉散出;突变体花粉败育始于花粉发育第10期,主要特征是花药外表皮结构异常、绒毡层降解延迟、乌氏体发育异常及花粉外壁形成缺陷,小孢子从第10期开始降解,最后导致无花粉型雄性不育。2.OsNP2基因定位运用分子标记,将OsNP2定位于第3染色体上,位于SSR标记0305和In Del标记C03D3之间。基因距离两个标记的遗传距离分别为0.41 c M和0.82 c M,定位区间物理距离为0.7 Mb。3.OsNP2候选基因确定利用改进的MutMap方法在C03D3和0305定位区间内,仅发现一个G-A碱基替换的突变,该突变位于编号为MH03g0072500（Gramene登录号为LOC＿Os03g07140,基因名DPW:Defective Pollen Wall）的基因的5’UTR中,将其确定为候选基因。4.OsNP2基因结构和OsNP2蛋白分析根据Gramene预测,OsNP2基因的长度为4112 bp,共有9个外显子,编码一个长609 aa的蛋白产物。经过Uni Prot KB查询,发现OsNP2具有脂酰辅酶A还原酶（Fatty acyl-CoA reductase,FAR）活性,参与脂类代谢途径,对花粉外壁形成起着重要作用。该蛋白包含两个结构域,分别是位于135–437 aa的NAD-binding 4结构域和位于543-613 aa的Sterile结构域。5.OsNP2表达模式分析通过RT-qPCR分析OsNP2的时空表达模式,发现该基因在茎、叶、花、种子中均有表达,在根中不表达;该基因在第9期的颖花中表达最为旺盛,其他时期也有一定的表达,但相对较少;基因突变使突变基因在突变体颖花中表达上调。6.OsNP2敲除验证利用CRISPR/Cas9技术对OsNP2进行基因编辑,并对转基因后代进行分子检测和表型观察,发现纯合或双等位突变的转基因植株表现为无花粉型雄性不育,cas9-osnp2/cas9-osnp2×OsNP2/osnp2杂交后代育性分离比为1:1,因此LOC＿Os03g07140就是控制该雄性不育表型的目的基因。