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第一部分肿瘤坏死因子相关诱导凋亡配体以及联合丝裂霉素C对人膀胱癌细胞作用的体外实验目的检测肿瘤坏死因子相关诱导凋亡配体(Tumor necrosis factor relatedapoptosis-inducing ligand,TRAIL)对人膀胱癌细胞株体外生长的抑制作用和凋亡作用,以及TRAIL联合丝裂霉素C(MMC)治疗膀胱癌的协同作用。方法人膀胱癌细胞株T24、5637体外培养。将T24、5637膀胱癌细胞接种至96孔培养板,培养24h后分别加入浓度为1、10、100μg/L的TRAIL,0.1、1.0、10.0mg/L的MMC,不同浓度TRAIL和MMC作用24h,采用噻唑蓝比色(4,5-dimethy thiazoleor 2,5-diphenyl tetrazolium bromide,MTT)法分别检测膀胱癌细胞的生存率,并将单独用TRAIL、MMC与TRAIL联合MMC对膀胱癌细胞株T24、5637的生长抑制情况进行比较;将T24及5637膀胱癌细胞接种至12孔板,培育24小时后加入不同浓度的TRAIL、MMC、TRAIL联合MMC并作用12h,用流式细胞术检测不同处理组膀胱癌细胞的凋亡率和死亡率,并将单独用TRAIL、MMC与TRAIL联合MMC组进行比较。结果TRAIL能有效抑制人膀胱癌细胞株T24、5637的生长。①MTT实验结果:1、10、100μg/L的TRAIL对膀胱癌T24细胞的抑制率分别为26.4%、29.3%和37.7%,与无药物组比较差异有显著性(P＜0.01)。三种浓度的TRAIL对膀胱癌5637细胞的抑制率分别为13.7%、21.9%和59.1%,1μg/L TRAIL组与无药物组比较差异无显著性(P＞0.05),10、100μg/L TRAIL组与无药物组比较差异有显著性(P＜0.01)。10.0mg/LMMC对膀胱癌T24、5637细胞的抑制率分别为36.0%、26.7%;而100μg/L TRAIL联合10.0 mg/L MMC组对膀胱癌T24、5637细胞的抑制率分别达到58.4%、90.7%,联合用药有明显的协同作用,与单纯100μg/L TRAIL组、单纯10.0 mg/L MMC组相比差异有显著性(P＜0.05)。②流式细胞术检测结果:100μg/L TRAIL引起膀胱癌T24、5637细胞的凋亡,凋亡率分别为20.1%、47.5%,与无药物组1.9%、5.1%的凋亡率相比差异有显著性(P＜0.01);10.0mg/L MMC对膀胱癌T24、5637细胞的凋亡率分别为13.1%、18.1%;而100μg/L TRAIL联合10.0 mg/L MMC组对膀胱癌T24、5637细胞的凋亡率分别达到41.5%、61.5%,两者有明显的协同作用,与单纯100μg/L TRAIL组、单纯10.0 mg/L MMC组相比差异有显著性(P＜0.05)。结论在体外实验中,①TRAIL能有效地抑制人膀胱癌细胞株T24、5637的生长,诱导人膀胱癌细胞株T24、5637凋亡;②TRAIL联合MMC抑制人膀胱癌细胞株T24、5637生长和诱导人膀胱癌细胞株T24、5637凋亡具有协同作用。第二部分Ad-TRAIL以及联合MMC对膀胱癌作用的在体实验目的:建立人膀胱癌细胞株T24 BALB/c-nu小鼠皮下移植瘤模型;在体研究真核表达载体Ad-TRAIL转染T24膀胱癌组织的效果及其对膀胱癌的治疗作用,以及联合MMC治疗膀胱癌的协同作用。方法:①人膀胱癌细胞株T24体外培养。6周龄免疫缺陷小鼠(BALB/c-nu)共5只。在超净台内将小鼠右侧前肢根部背侧皮肤用75%酒精消毒后皮下接种0.2ml浓度为1×10~7个/ml的T24人膀胱癌细胞株悬液,等上述接种小鼠的肿瘤长至直径1cm大小时,处死小鼠,切取肿瘤。再切开肿瘤,取质地均匀处组织,切成2mm~3,10～15mg大小,分别移植至40只6周龄BALB/c-nu小鼠右前肢根部背侧皮下,每只小鼠移植1块。移植方法:先用75%酒精消毒移植处皮肤,切一0.4cm大小的皮肤切口,分离皮下组织,将组织块植入皮下,0号线缝合皮肤切口。继续按常规饲养小鼠并观察注射部位的变化。②上述BALB/c-nu小鼠模型40只,肿瘤长到0.4～0.6cm后随机分成四组,分别为单用MMC组(A组):腹腔注射0.1g/L MMC(10μl/g体重),连续注射7d;瘤内注射5×10~8pfu/ml Ad空载体0.1ml×3处,分别注射于肿瘤的4、8、12点,1次/2d,共3次;单用Ad-TRAIL组(B组):腹腔注射PBS(10μl/g体重)×7d,瘤内注射5×10~8pfu/mlAd-TRAIL 0.1ml×3处,1次/2d,共3次;联合Ad-TRAIL和MMC组(C组):瘤内注射Ad-TRAIL同B组,腹腔注射MMC同A组;对照组(D组):腹腔注射PBS(10μl/g体重)×7d,瘤内注射5×10~8pfu/ml Ad空载体0.1ml×3处,1次/2d,共3次。给药结束2周后脱颈处死荷瘤鼠,测量小鼠体重,所荷肿瘤的直径和重量。取出肿瘤制成常规病理切片观察。用RT-PCR和Western blot测量肿瘤组织内TRAIL mRNA及TRAIL蛋白的表达水平。结果:①第一批5只小鼠,有3只荷瘤模型建立成功,至细胞注射后50d,3只小鼠荷瘤直径达0.6～1.0cm,并经病理组织学证实;第二批40只小鼠肿瘤模型建立全部成功,成瘤率达100%,移植后4周所有小鼠肿瘤直径在0.4～0.6cm。②四组小鼠给药前体重及所荷肿瘤平均直径差异无统计学意义(P＞0.05);给药结束2周后,A、B、C组所荷肿瘤直径和重量均显著小于D组(P＜0.001),而C组又显著小于A、B组(P＜0.01),B组又显著小于A组(P＜0.001);A、C组体重均显著小于D组(P＜0.01),而B组和D组差异无统计学意义(P＞0.05);肿瘤组织病理切片镜下观察,组织坏死由多到少依次为C组、B组、A组和D组;B、C组肿瘤组织内均有TRAIL mRNA和TRAIL蛋白的表达,且两组间表达相对量差异无统计学意义(P＞0.05),而A、D组则无TRAIL mRNA和TRAIL蛋白的表达。结论:①成功构建裸鼠人膀胱癌细胞株T24皮下移植瘤模型;②在体实验中,Ad-TRAIL能成功转染T24膀胱癌组织且表达TRAIL蛋白;③TRAIL对T24人膀胱癌裸鼠移植瘤具有明显的抑制作用,且TRAIL联合MMC具有协同抗膀胱癌作用。