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帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是一种常见的中枢神经系统退行性病变,α-synuclein是最早发现的与帕金森病相关的基因,其正常的生理功能尚不是很清楚,已有研究表明它在突触可塑性的调节、突触囊泡的循环、神经递质的储存和分布、神经元的分化等过程中发挥作用,迄今对α-synuclein的研究主要集中在野生型与PD相关突变(A30P、E46K、A53T)与氧化应激、线粒体功能异常、泛素-蛋白酶体蛋白降解系统的障碍和细胞自噬功能异常之间的关系,而对α-synuclein及其PD相关突变(A30P、E46K、A53T)对神经系统发育,尤其是多巴胺能神经元发育影响的研究不是很多。人类胚胎干细胞(human embryonic stem cells, hESCs)具有自我更新和分化发育的潜能,目前利用人胚胎干细胞向神经细胞,尤其是多巴胺能神经元细胞分化的技术已比较成熟,该分化体系则能部分模拟人体正常的多巴胺能神经元发育分化,从而为我们研究α-synuclein及其PD相关突变(A30P、E46K、A53T)对多巴胺能神经元分化影响的研究提供了一个工具。目的：获得稳定表达野生型及PD相关突变型α-synuclein (A30P、A53T)的人胚胎干细胞系方法：用293FT细胞对实验室已构建好的野生型和突变型(A30P、A53T)α-synuclein-FUIGW-GFP慢病毒载体进行包装,收获48h和72h的病毒上清并超速离心浓缩后,转染人胚胎干细胞(H9),然后用机械法将表达荧光的细胞团挑下来并进行扩大培养,鉴于每个胚胎干细胞团块的差异,将来自于同一个细胞团块的后代划为一个细胞系,在以后的传代中均根据GFP荧光对人胚胎干细胞进行筛选,并对获得的稳定表达野生型及PD相关突变型α-synuclein (A30P、A53T)的人胚胎干细胞系进行表面标记检测、体外拟胚体(embryoid body, EB)、体内畸胎瘤分化能力检测。结果：将收获的病毒上清超速离心浓缩后,转染人胚胎干细胞(H9),大约7天左右有GFP荧光出现,然后用机械法将表达荧光的细胞团挑下来并进行扩大培养,在以后的传代中均根据GFP荧光对人胚胎干细胞进行筛选,对获得的稳定表达野生型及PD相关突变型α-synuclein (A30P、A53T)的人胚胎干细胞系进行干细胞表面标记检测均为阳性,并且在体外均能形成拟胚体(embryoid body, EB),体内能形成畸胎瘤。结论：①稳定表达野生型α-synuclein和A30P、A53T突变的H9细胞保留了人胚胎干细胞的特性,具备体外体内分化的能力。②在H9细胞中野生型和突变型(A30P, A53T)α-synuclein在细胞核和细胞质内呈弥散样和一些颗粒样的分布,随着体外的继续培养,WT和A53T-a-synuclein蛋白表现为大的颗粒和囊泡样的结构。目的：比较野生型及PD相关突变型α-synuclein (A30P、A53T)对人胚胎干细胞向多巴胺能神经元分化的影响。方法：首先扩大培养稳定表达α-synuclein及其PD相关突(A30P、A53T)的H9细胞系,用Dispase消化并用ES培养基悬浮培养3天后,再用NPC培养基加bFGF培养3天,然后贴壁培养在包被有多聚鸟苷酸和层粘连蛋白的培养皿内,用NPC培养基加FGF8和Shh培养6天后,挑取出现的“玫瑰花样”团块,在NPC培养基加FGF8、SHH, B27, AA悬浮培养一周后,用accutase/trypsin(1：1)消化神经球后,种在包被有laminin的爬片上,用NPC培养基加神经营养因子BDNF、GDNF、FGF8、SHH、B27、AA、cAMP、laminin培养,隔天换液。数天后检测TH及α-synuclein的表达。结果：在整个分化过程中,稳定表达野生型和突变α-synuclein人胚胎干细胞系均能形成神经前体细胞及多巴胺能神经元。在分化而来的神经前体细胞,多巴胺能神经元和非多巴胺神经元中,WT和A53T-α-synuclein在细胞质内呈大的颗粒样的分布,没有了在胚胎干细胞中的大的囊泡样的结构,而A3 OP-α-synuclein主要为弥散样的小颗粒分布。结论：①稳定表达野生型和突变a-synuclein人胚胎干细胞系均能形成神经前体细胞,多巴胺能神经元。②在分化而来的神经前体细胞,多巴胺能神经元和非多巴胺神经元中,WT和A53T-α-synuclein主要在细胞质内呈大的颗粒样的分布,而A30P-α-synuclein主要为弥散样的小颗粒分布。