曲马多和对乙酰氨基酚均是临床上常用的镇痛药,常用于轻、中度疼痛的缓解,较少应用于神经病理性疼痛的治疗,对其作用机制的研究也知之甚少；而将两者联合应用于神经病理性疼痛的治疗,目前更是缺乏相应的实验研究。本研究通过脊髓腰5(L5)神经的结扎横切建立大鼠的神经病理性疼痛模型,研究了曲马多联合对乙酰氨基酚对大鼠机械痛觉超敏和热痛觉过敏的影响,并从小胶质细胞及多种促/抗炎因子入手对其机制进行了初步探索。 研究一 神经病理性疼痛模型的建立和相关机制的研究 一、大鼠神经病理性疼痛模型的建立以及机械、热痛阈改变情况 从出生10～15周,体重230～280g的雄性大鼠中筛选出痛觉反应正常大鼠,按照Kim和Chung的方法通过脊髓腰5神经的结扎横切建立神经损伤模型,术后观察一般行为学情况,在术后第1、3、7、11、14和21天分别用von Frey法和Hargreaves法测量机械缩足反射阈值和热缩足潜伏期。结果表明：脊神经损伤术后大鼠一般情况良好,出现了明显的机械痛觉超敏和热痛觉过敏表现,并在第3天达到高峰,证明大鼠神经病理性疼痛模型制作成功。 二、大鼠神经病理性疼痛模型相关机制的研究 (一)小胶质细胞在神经病理性疼痛大鼠脊髓的表达情况 大鼠脊神经损伤手术后第1、3、7、11、14、21天,完成机械和热痛阈测量后,多聚甲醛灌注处死动物,取脊髓L4.5节段用免疫组化方法观察脊髓小胶质细胞的表达活性。结果显示：免疫标记物OX-42标记阳性的小胶质细胞在正常脊髓后角表达较少,胞体较小,表面有小棘突和细长分支；手术后各时间点小胶质细胞明显增生,且分支变粗变长,呈阿米巴样分叉变形。通过细胞计数发现,术后小胶质细胞表达第3、7天达到高峰,随后逐渐减少,到第21天逐渐恢复术前水平,与大鼠的痛阈改变趋势类似。 (二)促/抗炎细胞因子在神经病理性疼痛大鼠脊髓及脑中的变化 脊神经损伤手术后第1、3、7、11、14、21天,完成机械和热痛阈测量后,处死动物,取整段脊髓组织(颈髓至骶髓)和全脑组织,用酶联免疫吸附法(ELISA)检测脊髓和脑组织中多种细胞因子TNF-α、IL-1β、前列腺素E2(PGE2)、及白介素-10(IL-10)的表达情况。结果显示：与正常大鼠相比,术后脊髓、脑组织中炎性细胞因子TNF-α、IL-1β和PGE2表达显著增高,均在第3天达到最高峰(PGE2在术后第7天),变化趋势与痛阈值变化一致；而抗炎因子IL-10的表达则在术后逐渐增加,在第21天达到最高峰。 (三)核转录因子NF-κB在神经病理性疼痛大鼠脊髓及脑中的变化 大鼠行脊神经损伤手术后第1、3、7、11、14、21天,用凝胶电迁移法进行脊髓和脑组织核因子-κB(NF-κB)活性测定。结果显示：与正常大鼠相比,术后脊髓和脑组织中的NF-κB表达明显增加,并均在第3天达到最高峰,说明脊神经损伤手术可以诱导核转录因子NF-κB表达,并使其在整个实验过程中均保持较高的水平。 研究二 曲马多联合对乙酰氨基酚对神经病理性疼痛大鼠模型的协同治疗作用 一、腹腔曲马多联合对乙酰氨基酚对神经病理性疼痛大鼠模型协同治疗作用 将制备成L5脊神经损伤术的实验动物随机分为10组,术后第7天腹腔分别注射对乙酰氨基酚40(Ⅰ组)、80(Ⅱ组)和160 mg/kg(Ⅲ组),曲马多5(IV组)、10(V组)和20 mg/kg(VⅠ组),对乙酰氨基酚40 mg/kg+曲马多5 mg/kg(VⅡ组),对乙酰氨基酚80 mg/kg+曲马多10 mg/kg(VⅢ组),对乙酰氨基酚160 mg/kg+曲马多20 mg/kg(IX组),生理盐水对照组(X组)。结果显示:与生理盐水组相比,除各对乙酰氨基酚组及曲马多5mg/kg组外,其余各组在给药后各时间点均能显著提高大鼠的机械和热痛阈值,明显减轻机械痛觉超敏和热痛觉过敏表现；与单独应用曲马多相比,曲马多联合对乙酰氨基酚腹腔注射对脊神经部分结扎大鼠机械性痛觉超敏和热痛觉过敏具有协同的抗伤害感受性作用。 二、鞘内曲马多联合对乙酰氨基酚对神经病理性疼痛大鼠模型协同治疗作用 将制备成L5脊神经损伤术的实验动物随机分为10组,术后第七天鞘内分别注射对乙酰氨基酚8ug(Ⅰ组)、40ug(Ⅱ组)和80ug(Ⅲ组),曲马多1ug(IV组)、5ug(V组)和10 ug(VⅠ组),对乙酰氨基酚8ug+曲马多1ug(VⅡ组),对乙酰氨基酚40ug+曲马多5ug(VⅢ组),对乙酰氨基酚80ug+曲马多10ug(IX组),生理盐水对照组(X组)。结果显示:与生理盐水组相比,除各对乙酰氨基酚组及曲马多1ug组外,其余各组在给药后各时间点均能显著提高大鼠的机械和热痛阈值,明显减轻机械痛觉超敏和热痛觉过敏表现；与单独应用曲马多相比,曲马多联合对乙酰氨基酚鞘内注射对脊神经部分结扎大鼠机械性痛觉超敏和热痛觉过敏具有协同的抗伤害感受性作用。 研究三 曲马多联合对乙酰氨基酚对神经病理性疼痛大鼠模型的影响及其相关机制的研究 一、曲马多联合对乙酰氨基酚对神经病理性疼痛大鼠模型形成和建立后行为学的影响 (一)曲马多联合对乙酰氨基酚对神经病理性疼痛大鼠模型形成的行为学的影响 将制备成L5脊神经损伤术的实验动物随机分为4组,分别在手术后当天开始腹腔注射以下各组药物,每天两次(10:00、20:00),连续七天。(1)曲马多20mg/kg+对乙酰氨基酚160mg/kg、(2)曲马多20mg/kg、(3)对乙酰氨基酚160mg/kg、(4)生理盐水。结果显示:与生理盐水对照组相比,单纯曲马多组和曲马多联合对乙酰氨基酚组均能抑制神经病理性疼痛大鼠热痛敏和机械超敏的形成,以第3天至第7天的抑制作用最明显,而且曲马多联合对乙酰氨基酚组表现出的抑制作用可一直持续至21天。 (二)曲马多联合对乙酰氨基酚对神经病理性疼痛大鼠模型建立后的行为学的影响 将脊神经损伤实验动物随机分为四组：分别在手术后第7天开始腹腔注射以下各组药物,每天两次(10:00、20:00),连续七天。(1)曲马多20mg/kg+对乙酰氨基酚160mg/kg、(2)曲马多20mg/kg、(3)对乙酰氨基酚160mg/kg、(4)生理盐水。与生理盐水组相比,手术后第7天开始连续给与曲马多+对乙酰氨基酚能减轻疼痛行为学表现,以术后第7天至第14天最明显,但与假手术组相比,MWT和TWL值仍有显著差异,而停止给药后,曲马多+对乙酰氨基酚组的MWT和TWL值的差异与生理盐水组相比,差异无统计学意义。 二、曲马多联合对乙酰氨基酚对神经病理性疼痛大鼠模型形成和建立后脊髓中小胶质细胞表达的影响 通过免疫组化方法观察不同给药组L4-5节段小胶质细胞的表达情况。结果显示：各组动物脊神经损伤术后OX-42标记阳性的小胶质细胞均显著增生,胞体肥大、分支增多呈树叉样,主要分布于手术侧脊髓后角的灰质之中；与生理盐水注射组相比,预先给与曲马多联合对乙酰氨基酚组小胶质细胞表达含量均明显减少,以术后第7天达到最高峰,至术后21天可恢复正常,而单纯曲马多或对乙酰氨基酚对小胶质细胞表达的影响与生理盐水组相比较差异不明显；而与生理盐水组相比,术后第7天开始连续给与曲马多+对乙酰氨基酚组中小胶质细胞表达含量减少不明显。 三、曲马多联合对乙酰氨基酚对神经病理性疼痛大鼠模型形成和建立后脊髓中促/抗炎细胞因子含量的影响 运用ELISA的方法检测了不同给药组大鼠在脊神经损伤术后第1、3、7、11、14和21天,脊髓和脑组织的TNF-α、IL-1β、PGE2及IL-10的表达情况。结果显示：与生理盐水组相比,对乙酰氨基酚组、曲马多联合对乙酰氨基酚组均能抑制术后各时间点脊髓和脑组织中的促炎因子TNF-α、IL-1β、PGE2水平；并同时可显著刺激抗炎因子IL-10的表达,在术后第11天达到高峰；与生理盐水组相比,术后第7天开始连续注射曲马多+对乙酰氨基酚也能抑制促炎细胞因子的表达、增加抗炎细胞因子的含量,变化趋势与大鼠机械和热痛阈的缓解趋势一致。 四、曲马多联合对乙酰氨基酚对神经病理性疼痛大鼠模型形成和建立后脊髓及脑中NF-κB的影响。检测不同给药组大鼠在脊神经损伤术后第1、3、7、11、14和21天,脊髓和脑组织的NF-κB活性变化情况。结果显示：与正常大鼠相比,术后生理盐水注射组大鼠脊髓和脑中的NF-κB表达明显增加,并在第3天达到最高峰,在第14天达到第2个小高峰；与生理盐水组相比,预先腹腔联合注射曲马多+对乙酰氨基酚能显著抑制脊髓和脑中NF-κB的活性,与大鼠的痛阈值变化趋势类似；与生理盐水组相比,术后第7天开始腹腔联合注射曲马多+对乙酰氨基酚对脊髓和脑中NF-κB活性的抑制并不明显。 结论：本研究中通过L5脊神经损伤手术建立大鼠的神经病理性疼痛模型,研究曲马多联合对乙酰氨基酚对大鼠机械和热痛觉敏感程度的影响,并检测了与疼痛相关的NF-κB、多种促/抗炎因子和小胶质细胞的表达情况,对其作用机理进行了探讨。研究发现小胶质细胞及其释放的炎性介质在痛觉超敏和痛觉过敏的形成和发展中发挥了一定的作用,中枢神经系统的神经炎症和神经免疫反应参与了病理性疼痛的调节过程；而曲马多联合对乙酰氨基酚腹腔注射能预防大鼠神经病理性疼痛的形成,这可能与其抑制中枢神经系统的小胶质细胞表达、NF-κB活性、促炎因子含量及上调抗炎因子水平有关,为临床用药提供了实验依据。