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背景及目的:慢性前列腺炎疼痛是泌尿外科中青年男性极其常见的一种病症。既往的研究主要集中于前列腺本身病因的探讨,而缺乏对前列腺炎疼痛的传导通路和神经调控机制的研究。目前研究发现部分慢性前列腺炎疼痛呈现出两个明显的特点:一、疼痛的泛化,疼痛不仅限于前列腺所在部分,而是分布在与膀胱尿道神经支配相关的骶神经支配区,在没有原发病变的其它部位可出现自发疼痛,并不同程度地存在着膀胱和尿道肌肉的功能障碍,表现出内脏牵涉痛的特点;二、疼痛的持续,临床上可见有些前列腺炎疼痛在前列腺检查完全正常后仍存在持续疼痛。所以各种临床现象提示:慢性前列腺炎疼痛极可能是一种持续的神经牵涉痛,其疼痛的发生估计与支配前列腺的L5-S2脊段的改变有关。本室对慢性前列腺炎疼痛的系列研究(见宋波,周占松,陈勇等的工作)现已得到了如下结果:1.成功构建了慢性前列腺炎疼痛的大鼠模型;2.进一步证实慢性前列腺炎疼痛是中枢位于L5-S2脊段的神经牵涉痛。但对于慢性前列腺炎疼痛L5-S2脊段神经调控机制的相应变化仍不清楚。目前研究证实,星形胶质细胞和SP(P Substance, P物质)参与了多种慢性疼痛的发生,部分神经躯体痛模型中已发现相应脊段存在星形胶质细胞的活化和SP免疫活性的增强,但对于星形胶质细胞和SP在慢性前列腺炎疼痛中的作用尚无相关研究,因此,进一步研究SP与脊髓星形胶质细胞在慢性前列腺炎疼痛L5-S2脊段中的改变及相互之间的关系,将对阐明部分慢性前列腺炎疼痛的发生机理具有重要意义。一、活化的星形胶质细胞参与多种慢性疼痛的调制。随着对中枢神经系统研究的深入,发现痛觉的传导和调制不仅仅是神经元的功能,星形胶质细胞也通过和神经细胞的相互作用参与了病理性疼痛的产生和维持。已有研究发现星形胶质细胞在神经病变中存在免疫和内分泌方面的病理改变,不仅影响致痛递质谷氨酸的代谢,还可通过旁分泌和内分泌等方式,产生多种致炎因子和趋化因子,如TNF,IL-1,IL-6等,和慢性疼痛的产生密切相关。二、SP是一种重要的致痛神经递质和调质。SP通过从初级传入神经释放后作用于脊髓背角相应的受体,向中枢传递伤害性刺激和痛觉,广泛参与痛觉的传导和调制,在多种慢性疼痛中表达升高。目前对于慢性前列腺炎疼痛大鼠L5-S2脊髓是否存在星形胶质细胞活化和SP表达的具体变化,以及二者之间的相互关系尚不清楚,有待进一步的研究。本课题作为向该研究方向探索的一个分题,主要对慢性前列腺炎疼痛中L5-S2脊段的星形胶质细胞活化参与疼痛调制的细胞分子机制、信号通路以及其中SP的作用进行研究,以期初步阐明慢性前列腺炎疼痛的部分神经调控机制并为临床上的相应的治疗提供新的参考思路。方法:1.第一部分观察慢性前列腺炎疼痛是否存在L5-S2脊段SP合成、相应受体表达及星形胶质细胞活化和炎性因子分泌的变化,即通过制作大鼠慢性前列腺炎疼痛模型,分别应用FQ-RT PCR(实时荧光定量RT PCR)和Western-blot检测L5-S2脊段DRG(dorsal root ganglion,背根神经节)传入神经细胞SP合成和脊髓后角NK-1R(SP受体)、GFAP(glial fibrillary acidic protein,胶质纤维酸性蛋白)、iNOS和TNF-α表达的变化。2.第二部分在体外观察SP是否促使脊髓星形胶质细胞活化、分泌炎性因子及影响谷氨酸代谢,即通过体外培养大鼠脊髓星形胶质细胞,采用不同浓度的SP在一定时间刺激培养的细胞,利用ELISA法,硝酸还原酶和比色法检测星形胶质细胞IL-1β、TNF-α、NO分泌和NOS表达的变化,3H-Glu掺入法检测谷氨酸的掺入;RT-PCR法检测GFAP和GLT-1(glutamate transporter-1,谷氨酸转运体-1)的表达。3.第三部分对SP激活脊髓星形胶质细胞的信号转导途径进行初探,即利用一定浓度的SP在不同时间刺激培养的细胞,通过Western-blot检测P38MAPK的磷酸化变化和RT-PCR法检测C-fos的改变,及SB203580阻断P38MAPK信号通路后上述炎性因子分泌的变化。结果:主要研究结果如下:1.大鼠前列腺注射CFA的慢性前列腺炎疼痛模型中,L5-S2脊髓DRG神经元中的SP合成和脊髓背角NK-1R的表达在6d和12d均明显高于对照组(P<0.01),12d和6d组明显高于0d组(P<0.01)。2.慢性前列腺炎疼痛大鼠中L5-S2脊髓背角中GFAP、TNF-α、iNOS表达在6d和12d均明显高于各自正常对照组和0d组(P<0.01),GFAP 12d组高于6d组(P<0.05),iNOS的表达高峰在6d组(P<0.01)。3.成功分离、培养和纯化大鼠的脊髓星形胶质细胞,并用GFAP鉴定纯度达95%以上。4. SP在10-9-10-6mol/L浓度范围内呈浓度依赖性促进脊髓星形胶质细胞分泌TNF-α、IL-1β、NO和NOS,各浓度组与对照组相比差异显著(P<0.01,P<0.05),但在10-6mol/L SP作用组,IL-1β的分泌下降且与正常对照组没有明显差异(P>0.05)。5.在SP(10-7mol/L)的作用下,脊髓星形胶质细胞内GFAP的表达在0-72h逐渐升高,与正常对照组相比差异非常显著(P<0.01)。6.脊髓星形胶质细胞在SP的刺激下,3H-Glu的摄取逐渐下降,10-9mol/L组与正常对照组有显著差异(P<0.05),10-8-10-6mol/L SP作用下,脊髓星形胶质细胞3H-Glu摄取与正常对照组有非常显著差异(P<0.01)。7.脊髓星形胶质细胞GLT-1的表达在10-9-10-8mol/L SP作用组和正常对照组没有显著差异(P>0.05),10-7-10-6mol/L SP刺激组GLT-1表达值低于正常对照组(P<0.05, P<0.01)。8. SP(10-7mol/L)刺激使P38MAKP明显磷酸化活化,其光密度值在15、30、45、60min均明显高于对照组(P<0.05, P<0.01),表达高峰在45min。9. SP(10-7mol/L)作用使C-fos明显表达,在30min、1h、3h、6h均明显高于对照组(P<0.05, P<0.01),在3h达到高峰。10. SP(10-7mol/L)刺激脊髓星形胶质细胞明显分泌炎性因子IL-1β、TNF-α和NO (P<0.01),SB203580阻断P38MAKP信号通路后TNF-α和NO的分泌明显下降(P<0.01),IL-1β的分泌在阻断前后没有显著差异(P>0.05),单纯SB203580阻断组和正常对照组间均无明显差异(P>0.05)。结论:1.成功制作了慢性前列腺炎疼痛大鼠模型,并观察到L5-S2脊段存在致痛神经递质SP作用的增强。2.慢性前列腺炎疼痛可以引起L5-S2脊髓背角星形胶质细胞标志物GFAP表达增加,炎性因子TNF-α和iNOS表达升高,表明慢性前列腺炎疼痛可以导致L5-S2脊髓中枢继发的星形胶质细胞活化及炎性改变,可能与慢性前列腺炎疼痛的持续和泛化有密切关系。3. SP刺激下的脊髓星形胶质细胞GFAP、TNF-α,IL-1β、NO、NOS合成增加,表明脊髓星形胶质细胞活化与SP诱导有明显关系。结合动物实验的结果证明:慢性前列腺炎疼痛中SP诱导下脊髓星形胶质细胞活化和炎性因子分泌可以导致L5-S2脊段神经炎性痛反应。4. SP作用下脊髓星形胶质细胞谷氨酸转运体GLT-1表达和谷氨酸掺入减少,表明SP作用可能使脊髓星形胶质细胞谷氨酸的转运下降,谷氨酸在相应脊髓中枢局部堆积可并发更严重的神经损害和疼痛。5. SP作用下脊髓星形胶质细胞P38MAPK和C-fos信号通路均激活,表明P38MAKP和C-fos是SP诱导脊髓星形胶质细胞活化的部分信号转导途径。