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研究背景: 锌是一种对生命至关重要的微量元素,在许多生物化学反应中起着举足轻重的作用。锌是细胞增殖及分化所必需的,并参与蛋白质、核苷酸、糖以及脂类的代谢以及调节机体的免疫功能。哺乳动物中有两个锌转运体蛋白家族直接参与细胞内锌离子的稳态平衡,即SLC39A和SLC30A两大家族。SLC39A编码ZIP蛋白,能够增加细胞外锌内流或促进细胞器内锌释放入胞浆,从而提高胞浆中锌的含量。SLC30A编码CDF蛋白,CDF蛋白也被称为ZnT蛋白,通过促进胞浆内锌外流和锌在细胞器内区室化分布而降低胞浆中锌的含量。 缺锌普遍存在,在儿童中尤为常见。缺锌时骨生长减慢可导致脊柱动物生长迟缓。生长激素是由垂体分泌的,能刺激骨的生长和儿童生长密切相关。锌可以诱导人类生长激素的二聚化并能增强其生物学功能,因此锌和生长激素存在一定的联系。对人类锌调节的基因进行全基因阵列分析发现ZIP2对缺锌是最敏感的,近来有研究发现ZIP8在多器官形成及造血等方面有重要作用,ZIP8敲除后小鼠生长迟缓,多种组织内锌水平降低。因此,我们探讨身材矮小儿童的生长激素与锌及锌转运体的关系;并构建了大鼠缺锌模型,原代培养大鼠垂体细胞,在体内外研究缺锌情况下大鼠垂体ZIP2和ZIP8的表达水平。 研究目的:通过观察矮小儿童生长激素激发试验中锌转运体的表达情况,探讨生长激素与锌及锌转运体之间的关系;构建大鼠缺锌模型,原代培养大鼠垂体细胞,体内外研究缺锌对大鼠垂体中ZIP2及ZIP8表达的影响。 实验方法: 一、生长激素激发试验用来鉴定是否存在生长激素缺乏。分别于空腹及服用刺激生长激素分泌的药物30分钟、60分钟及90分钟后抽血检测生长激素水平。临床收集接受生长激素激发试验的6名身材矮小儿童及15名正常对照儿童的新鲜抗凝外周血标本,并收集其血清检测锌含量。以密度梯度离心法分离样本中的单个核细胞(PBMCs),分别提取总RNA及总蛋白。通过实时定量的方法检测锌转运体ZIP1,ZIP2,ZIP6ZIP8及ZnT1mRNA的表达情况,通过Western-blot的方法检测ZIP2和ZIP8的蛋白表达情况。 二、构建Wistar大鼠缺锌模型,检测缺锌时大鼠垂体中ZIP2和ZIP8mRNA的表达情况。同时原代培养大鼠垂体细胞,用不同浓度TPEN缺锌处理后观察细胞形态,并检测ZIP2和ZIP8mRNA的表达情况。 实验结果: 一、在矮小儿童生长激素激发试验中,生长激素浓度和ZIP1及ZIP2mRNA水平呈正相关(r=0.5133,P=0.0371;r=0.6719,P=0.0030);和ZIP8呈负相关(r=-0.5264,P=0.0285)。矮小儿童组ZIP2的表达水平高于对照组(P<0.05),而ZIP6和ZIP8表达水平低于对照组(P<0.05,P<0.05)。 二、缺锌组大鼠垂体中ZIP8的表达量低于对照组(P<0.05),ZIP2的表达量也低于对照组,但无统计学意义(P>0.05)。对培养的大鼠垂体原代细胞进行缺锌处理后ZIP2和ZIP8表达上调,并且TPEN浓度越高,表达上调越明显,特别ZIP2上调非常显著(P<0.05,P<0.05)。 结论: 生长激素浓度和ZIP1及ZIP2mRNA水平呈正相关;和ZIP8呈负相关。矮小儿童组ZIP2的表达水平高于对照组,而ZIP6和ZIP8表达水平低于对照组。提示生长激素与锌及锌转运体之间存在一定的内在联系。 体内缺锌时大鼠垂体中ZIP8的表达降低,但是对培养的大鼠垂体原代细胞进行缺锌处理后ZIP2和ZIP8的表达均明显上调,提示在体内外垂体细胞对缺锌环境中ZIP2和ZIP8的表达水平不同。