小麦(Triticum aestivum L.)是世界上最重要的粮食作物之一。小麦在生长发育过程中经常受到各种逆境胁迫。泛素/26S蛋白酶体系统(UPS)是植物中最重要的蛋白质周转机制之一。该系统主要由泛素活化酶(E1)、泛素结合酶(E2)、泛素连接酶(E3)、26S蛋白酶体和泛素组成。研究发现UPS参与许多生物过程,包括信号转导、细胞周期和逆境胁迫响应等。泛素是一个含有76个氨基酸的球状蛋白,存在于几乎所有的真核生物中,且高度保守。它主要以两种类型存在:单体泛素和多聚化泛素。在植物细胞中,游离态的泛素和结合态的泛素处于动态平衡中。尽管细胞内泛素水平相对较高,但是自由的未结合的泛素非常的少。在胁迫条件下,植物细胞会积累大量的异常和受损的蛋白质。及时清除这些非正常蛋白具有重要意义,而这个过程受自由态泛素水平的影响。E3连接酶是UPS系统的关键酶,它决定了被泛素化蛋白的特异性。根据亚基构成和作用机制,植物中的E3主要有:HECT结构域家族、RING结构域家族和U-box结构域家族等。U-box结构域最先在酵母中发现的,是一个大约含有75个氨基酸的高度保守的结构域。已鉴定的许多含U-box结构域的蛋白随后都发现具有E3连接酶的活性。本实验室之前克隆了小麦泛素基因TaUb2,并获得了过表达烟草(Nicotiana tabacum L.)株系。本文我们利用过表达TaUb2烟草研究了该基因在植物生物胁迫耐性中的功能。同时,我们还从小麦中分离到一个新的U-box基因TaPUB1。对该基因进行序列比对并对其表达模式进行分析。构建真核表达载体,通过农杆菌介导的叶盘法转化本生烟,从而获得了TaPUB1过表达的本生烟植株。利用转基因植株对基因在逆境适应中的功能进行了深入研究。主要结论如下:1.TaUb2在植物生物胁迫耐性中的功能(1)丁香假单胞杆菌Pst DC3000属于革兰氏阴性细菌,被广泛地用于研究植物的生物胁迫响应。Pst DC3000处理后,与野生型烟草相比,TaUb2过表达烟草叶片中的细菌生物量减少且叶片坏死、萎黄现象较轻。同时还发现Pst DC3000处理小麦能显著上调内源TaUb2的表达。这些结果表明TaUb2过表达烟草能够提高对Pst DC3000的抗性。(2)经Pst DC3000处理后,转基因植物的气孔孔径变小,仅为野生型烟草的1/2-2/3。同时,我们又对感染Pst DC3000的各个株系叶片进行失水速率检测。结果发现,与野生型相比,过表达烟草的失水速率较慢,这与经Pst DC3000处理后过表达烟草叶片的气孔孔径较小一致。pstdc3000处理后,与野生型相比,过表达烟草的电解质外渗量和丙二醛含量较低,apx、pod和sod的酶活升高。这些结果表明,气孔开度的减小和抗氧化能力的提高可能参与转基因植株的抗病性。(3)注射pstdc3000后,转基因烟草中观察到更多的活性氧和超敏反应。同时,pstdc3000处理后,发现参与sar信号途径的几个pr基因在转基因烟草中上调幅度明显高于野生型烟草。这些结果表明ros诱导的、hr激活的sar可能参与转基因植株的抗病性。2.小麦u-box基因tapub1的克隆与功能研究(1)通过同源克隆策略从小麦中分离到一个u-box基因tapub1(jx307854)。该基因cdna全长为1932bp,开放阅读框为1593bp,共编码531个氨基酸。该蛋白的分子量约为57.8kda,等电点为5.96。该蛋白的n端有保守的u-box结构域和prp19超家族,c端有几个wd40重复片段。(2)将p35s-tapub1-gfp融合蛋白在洋葱和本生烟表皮中瞬时表达。通过荧光显微镜观察到荧光蛋白分布在胞质和细胞核中。(3)qrt-pcr检测tapub1在小麦不同部位的表达以及在各种外源激素和逆境胁迫处理下的内源tapub1的表达模式。结果表明tapub1在小麦根、茎和叶中均有表达,其中叶片中的表达最丰富。nacl、peg6000、cdcl2、pstdc3000等逆境胁迫均能诱导tapub1上调表达。外源施加植物激素如aba、sa、meja和eth也可不同程度地诱导该基因的表达。(4)将tapub1cdna全长正向插入到植物表达载体prok2的camv35s启动子的下游。利用农杆菌介导的叶盘法转化本生烟。通过抗性筛选、转录水平及蛋白水平的检测,最终选取了oe9、oe10、oe113个过表达株系并用于进一步的研究。结果发现,过表达tapub1提高了本生烟对盐胁迫的耐性。盐胁迫条件下,与野生型相比,过表达株系的种子萌发率较高,而且发芽速度快;与野生型植株相比,过表达tapub1幼苗及成苗在盐胁迫下表现出较长的主根,较高的叶绿素含量和较好的生长表型。这些说明过表达tapub1提高了本生烟的耐盐性。(5)盐胁迫下,过表达植株中积累较多的脯氨酸和可溶性糖,水势较低,表明转基因植株通过增加渗透调节物质的积累,降低水势,进而在一定程度上缓解由盐胁迫造成的水分胁迫。盐胁迫还会对植物造成离子毒害。过表达株系通过减少na+吸收,降低na+/k+比率,进而在一定程度上维持离子平衡,减轻离子毒害。盐胁迫存在的同时还伴随着氧化胁迫。转基因植株通过提高抗氧化酶的活性,及时清除ROS,进而减轻由ROS引发的氧化伤害。在盐处理时,一些渗透胁迫和抗氧化酶相关基因在转基因植物中的表达水平明显地高于野生型。(6)过表达TaPUB1还能提高本生烟对水分胁迫、重金属镉的耐性,同时增加了本生烟对Pst DC3000的感病性。(7)过表达TaPUB1影响本生烟的生长发育。对转基因本生烟的表型观察发现,过表达TaPUB1影响了本生烟的整个生长发育过程,包括种子大小、叶片厚度、叶片数目和株高等。