在免疫治疗领域,免疫接种用于疾病预防和治疗越来越备受关注。在免疫接种中,由于疫苗的弱免疫原性,有效的疫苗佐剂显得十分重要。一些传统的疫苗佐剂已经被广泛使用,但已被证明具有明显的缺陷,如生物安全性欠佳。因此,研究人员致力于设计开发更多功能化的新型免疫佐剂,如基于壳聚糖的免疫佐剂。然而,即使壳聚糖具有良好的生物相容性,生物可降解性和其他生物活性,水溶性差的缺点极大限制了其作为免疫佐剂的应用。在本项研究中,我们制备了一种水溶性壳聚糖衍生物磷酸化壳聚糖(PCS),并评估其作为一种新型免疫佐剂的潜力。我们发现PCS仍然保持壳聚糖原有的良好的生物相容性、生物黏附性,且具有一定的pH敏感性:具体地,PCS在pH<7.0条件下时是水溶的,但在pH>7.0时开始凝胶化,类似壳聚糖在碱性条件下的沉淀行为。由此,我们将含有卵清蛋白(OVA)抗原的中性PCS水溶液肌内注射到小鼠体中,其将转化为含OVA的具有良好黏附性的凝胶网络结构用于OVA免疫。而迄今为止,关于磷酸化壳聚糖作为免疫佐剂的应用仍然没有被研究。因此,基于磷酸化壳聚糖良好的理化性质,将磷酸化壳聚糖作为一种新型的免疫佐剂/疫苗递送系统用于免疫治疗比壳聚糖有更好的应用前景。本文的主要研究内容如下:1.磷酸化壳聚糖的合成表征及性质研究本文通过均相法改性壳聚糖,合成具有良好水溶性的磷酸化壳聚糖。通过红外光谱、核磁氢谱、X射线衍射分析等方法表征磷酸化壳聚糖;通过电感耦合等离子体发射光谱测定其磷元素含量;通过滴定法研究磷酸化壳聚糖的溶解性能;采用CCK-8法测定磷酸化壳聚糖的体外细胞毒性,评价生物安全性;通过旋转流变仪测试磷酸化壳聚糖的生物黏度;利用紫外吸收法测定磷酸化壳聚糖对OVA抗原的包封效率及体外释放行为,并采用圆二色谱及紫外光谱法研究磷酸化壳聚糖对OVA结构的影响。2.磷酸化壳聚糖作为疫苗递送系统的免疫效果研究用不同配方复合疫苗制剂通过肌肉注射方式免疫小鼠。第三次免疫10天后,眼球取血,分离血清;取脾脏,制备不同浓度的脾细胞悬液。通过ELISA法测定小鼠血清IgG及其亚型IgG1和IgG2a抗体效价、测定脾细胞因子IFN-γ、IL-12和IL-4、IL-10分泌水平;采用CCK-8法探讨脾细胞增殖情况;通过ELISpot法进一步测定IFN-γ-和IL-4-分泌型细胞数量;利用流式细胞术研究记忆T细胞免疫反应及检测CD11c+树突状细胞活化情况;采用荧光活体成像法可直观清晰地监测抗原在注射部位的停留时间及缓释放情况;通过免疫组化法研究抗原是否被抗原呈递细胞(APC)摄取并通过引流淋巴结呈递至脾脏;最后利用H&E染色法评价复合疫苗对脾脏免疫学功能及组织结构的影响。结果表明,基于30 mg/mL磷酸化壳聚糖作为疫苗递送系统有助于诱导显著高水平的抗原特异性免疫应答,包括更高水平的抗原特异性Ig G抗体及亚型效价,IFN-γ、IL-12和IL-4细胞因子分泌,以及记忆CD4+和CD8+T细胞百分比。动物荧光活体成像和免疫组织化学实验表明免疫功效的提高可归因于抗原通过PCS凝胶网络从注射部位缓慢释放,从而延长抗原刺激免疫系统时间。综合以上结果,磷酸化壳聚糖作为疫苗递送载体用于肌肉免疫接种具有良好的前景。