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鸡毒支原体(Mycoplasma gallisepticum,MG)引起的鸡慢性呼吸道疾病(CRD)是降低养禽业经济效益的重大疾病之一。该病在世界各地的鸡群中广泛存在,至今仍没有理想的防控手段,其致病机制有待进一步阐明。研究表明mi RNAs在疾病的发生发展过程中扮演着重要的角色,本试验旨在探讨Illumina深度测序筛选获得的gga-mi R-130b-3p对MG感染的作用,为深入了解MG的致病机制提供理论基础。试验以gga-mi R-130b-3p为研究对象,首先应用生物信息学技术预测及分析gga-mi R-130b-3p潜在的靶基因,利用双荧光素酶报告基因载体方法对靶基因进行初步验证;进一步通过超表达及抑制gga-mi R-130b-3p确证其与靶基因的负调控关系;利用q PCR分析MG-HS感染与非感染的SPF鸡胚肺组织及DF-1细胞中gga-mi R-130b-3p及靶基因的表达情况,确证深度测序结果及其靶基因;通过在线软件Ami GO,筛选得到gga-mi R-130b-3p可能通过PTEN/PI3K/AKT信号通路起作用;利用q PCR的方法检测超表达及抑制gga-mi R-130b-3p后PI3K、AKT及下游NF-κB的表达量;运用CCK-8法及流式细胞仪分析了MG感染及未感染的DF-1细胞增殖及周期的变化,解释gga-mi R-130b-3p在MG感染中的作用机制。主要结果如下:1.利用mi RDB、Target Scan软件及Pathway相关性分析预测gga-mi R-130b-3p的靶基因可能为PTEN,进一步应用RNAhybrid软件对gga-mi R-130b-3p与PTEN 3’非编码区(UTR)靶序列的碱基配对情况、RNA双链的二级结构和自由能以及靶序列在不同物种间的保守性等进行分析,同时结合Ami GO软件分析其靶基因的功能,初步确定PTEN为gga-mi R-130b-3p的靶基因。2.利用双荧光素酶报告基因分析显示:在DF-1细胞中超表达gga-mi R-130b-3p能极显著抑制PTEN 3’UTR双荧光素酶报告基因的活性;而gga-mi R-130b-3p抑制后,PTEN 3’UTR双荧光素酶报告基因的活性显著提高。初步验证PTEN可能是gga-mi R-130b-3p的靶基因。3.gga-mi R-130b-3p过表达和抑制实验显示:DF-1细胞中超表达gga-mi R-130b-3p能极显著下调PTEN的表达量(p<0.01);而抑制gga-mi R-130b-3p后,显著上调PTEN的表达量(p<0.01),说明gga-mi R-130b-3p负向调控PTEN的表达。进一步确证PTEN是gga-mi R-130b-3p的靶基因。4.动物和细胞实验表明:在MG-HS感染的细胞及鸡胚肺组织(孵化第14d、16d及18d)中,gga-mi R-130b-3p的表达量显著升高(p<0.05),与深度测序结果一致。与gga-mi R-130b-3p的表达结果相反,PTEN的表达量显著下调(p<0.05),阐明gga-mi R-130b-3p与PTEN呈负调控关系,PTEN是gga-mi R-130b-3p的靶基因。5.gga-mi R-130b-3p功能研究表明:gga-mi R-130b-3p超表达能够极显著上调PI3K、AKT及NF-κB基因的表达量(p<0.01);相反gga-mi R-130b-3p抑制后,PI3K、AKT及NF-κB基因的表达量均显著下调(p<0.05)。6.细胞增殖和周期实验表明:MG-HS感染后能显著降低DF-1细胞的增殖,阻滞细胞周期进程。gga-mi R-130b-3p mimics能显著促进MG-HS感染的DF-1细胞在24h、48h及72h的增殖,而gga-mi R-130b-3p inhibitor能显著地抑制感染细胞的增殖。同时,gga-mi R-130b-3p mimics能促进MG-HS感染的DF-1细胞周期进程,G2+S期细胞比例显著增加;而转染gga-mi R-130b-3p inhibitor后结果与之相反,G1期细胞的比例显著增多,而G2+S期细胞比例显著减少。该研究表明鸡感染MG后上调的gga-mi R-130b-3p抑制了靶基因PTEN的表达,激活PI3K/AKT/NF-κB信号通路,加快细胞周期进程,促进组织细胞的增殖来抵御机体的MG感染。