【摘 要】
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类风湿性关节炎（Rheumatoid arthritis,RA）是一种复杂的免疫疾病。目前,治疗RA的药物主要有糖皮质激素、生物疾病修饰抗风湿药和非甾体抗炎药等,但由于其发病机制的复杂性,成功治疗仍然是临床实践的主要挑战。中药复方三乌胶丸（SWJ）由川乌、黄草乌、何首乌、附子、白附子组成,临床上长期用于治疗RA。目前三乌胶丸治疗RA的分子机制尚不清楚。因此,本论文基于网络药理学筛选三乌胶丸治疗RA
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类风湿性关节炎（Rheumatoid arthritis,RA）是一种复杂的免疫疾病。目前,治疗RA的药物主要有糖皮质激素、生物疾病修饰抗风湿药和非甾体抗炎药等,但由于其发病机制的复杂性,成功治疗仍然是临床实践的主要挑战。中药复方三乌胶丸（SWJ）由川乌、黄草乌、何首乌、附子、白附子组成,临床上长期用于治疗RA。目前三乌胶丸治疗RA的分子机制尚不清楚。因此,本论文基于网络药理学筛选三乌胶丸治疗RA的潜在作用靶点;采用体内、外模型研究三乌胶丸治疗RA作用,探讨三乌胶丸及其活性化合物治疗RA的分子机制;并通过三乌胶丸的大鼠药代动力学研究,寻找三乌胶丸治疗RA的潜在质量标志物,为三乌胶丸的临床应用提供理论依据。主要研究内容和结论如下:1、三乌胶丸治疗类风湿性关节炎的网络药理学研究通过数据库和文献筛选出SWJ的活性成分55个;通过数据库筛选SWJ和RA的作用靶点,并通过韦恩图发现其共同靶点67个。构建了PPI网络和“中药-药物-靶点”网络,获得关键靶点20个,关键成分21个。通过SWJ和RA的共同靶点的GO功能和KEGG通路富集分析,发现三乌胶丸治疗RA作用与凋亡通路和炎症通路相关。2、三乌胶丸对类风湿关节炎滑膜成纤维细胞增殖、迁移及凋亡作用SWJ对人类风湿性关节炎滑膜成纤维细胞MH7A增殖具有显著的抑制作用（p＜0.001）;采用激光共聚焦显微镜观察,发现SWJ显著降低MH7A细胞的线粒体膜电位,促进MH7A凋亡。与对照组相比,SWJ显著上调MH7A细胞Caspase3、Caspase8、Caspase9及Bax m RNA表达水平（p＜0.05,p＜0.01,p＜0.001）,显著下调MCL-1和Bcl-2 m RNA表达水平（p＜0.05,p＜0.01,p＜0.001）。与对照组相比,SWJ显著上调MH7A细胞Bax/Bcl-2蛋白表达量比值和Caspase9蛋白表达量（p＜0.05）。因此,三乌胶丸通过介导Caspase信号通路调节MH7A细胞凋亡,从而治疗RA。3、三乌胶丸中4种乌头类生物碱对MH7A细胞增殖、迁移及凋亡的影响通过组效关系研究获得三乌胶丸中4个乌头类活性生物碱,分别为滇乌碱（YAC）、8-去乙酰滇乌碱（DYA）、粗茎乌头碱甲（CCA）、去乙酰粗茎乌头碱甲（DCA）。4个乌头类生物碱均具有抗MH7A细胞增殖作用,且呈剂量依赖性。利用细胞划痕实验发现4种生物碱可以有效抑制MH7A细胞的迁移。进一步研究发现4种生物碱可以显著下调基质金属蛋白酶相关基因MMP-1和MMP-2m RNA表达水平（p＜0.05）,从而抑制MH7A细胞的迁移。同时,4种生物碱可以显著降低MH7A细胞的线粒体膜电位,促进其早期凋亡。与空白组相比,4种生物碱显著上调MH7A细胞Bax和Caspase9蛋白表达水平（p＜0.001）,下调Bcl-2蛋白表达水平（p＜0.001）。因此,4种生物碱通过介导Caspase信号通路调节MH7A细胞凋亡作用。4、三乌胶丸对Ⅱ型胶原诱导类风湿性关节炎大鼠（CIA）的治疗作用及体内药代动力学研究SWJ能够显著减轻CIA大鼠的足肿胀、足厚度及关节炎评分（P＜0.05）;改善CIA大鼠踝关节软骨损伤。与模型组相比,SWJ组显著下调CIA大鼠脾脏组织TGF-β、IFN-γ、IL-17、TNF-α及IL-1βm RNA表达水平（p＜0.05,p＜0.01,p＜0.001）,上调Foxp3 m RNA表达水平（p＜0.01,p＜0.001）。与模型组相比,SWJ显著下调CIA大鼠踝关节组织中NF-κB、My D88、TLR4、IKB-α蛋白表达水平（p＜0.05）。三乌胶丸治疗类风湿性关节炎的作用可能与抑制NF-κB信号通路激活相关。采用UPLC-MS/MS技术鉴定了SWJ在CIA大鼠血浆中5个移行成分,分别为粗茎乌头碱甲、苯甲酰新乌头碱、8-去乙酰滇乌碱、滇乌碱和去乙酰粗茎乌头碱甲。根据4个入血成分的药代动力学参数,发现8-去乙酰滇乌碱和去乙酰粗茎乌头碱甲的生物利用度较高,而粗茎乌头碱甲体内吸收速率较高,但滞留短。结论:1、通过网络药理学方法预测SWJ治疗RA的作用靶点,并基于体外MH7A细胞模型验证了SWJ治疗RA的作用靶点和作用机制。SWJ治疗RA可能与关节炎成纤维细胞的凋亡相关。2、基于组效关系获得三乌胶丸中4种乌头类活性生物碱。这4种生物碱具有抑制MH7A细胞的增殖、迁移和促凋亡作用。3、三乌胶丸能够有效治疗Ⅱ型胶原诱导的类风湿性关节炎大鼠,其作用机制可能与抑制NF-κB信号通路激活相关。4、基于药代动力学筛选出三乌胶丸中5个入血成分,其中8-去乙酰滇乌碱和去乙酰粗茎乌头碱甲具有较高的生物利用度,而粗茎乌头碱甲在体内吸收速率较高。
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