随着我国人口老龄化的发展,心脑血管疾病发病率逐年递增,而大多数心脑血管疾病最终都会导致患者心衰,心衰疾病死亡率近年来大幅度递增。心衰,是很多复杂病因导致心肌收缩-舒张能力变低,引起心输出量相对减少的病理过程。在这一过程中,心衰患者心室内压和室壁张力增大即会导致心衰疾病标志物B型脑钠肽(Brain Natriuretic Peptide,BNP)的释放,血液中BNP含量会随着心衰的严重程度从正常的~6 pM水平增加到~600 pM;还有心肌细胞中最重要的第二信使钙离子(Ca2+),随着心动周期变化,通过肌浆网对Ca2+吸收、储存、释放调节细胞内Ca2+浓度,从而调节心肌的兴奋-收缩耦联过程,三个环节中任意一个出现障碍,都将影响该过程,致使心肌收缩力下降,引起心衰。因此,我们选择这两种具有代表性的与心衰相关的标志物,希望分别在血浆中和细胞水平上进行研究,实现心衰疾病的高灵敏度、快速检测,有利于心衰疾病的早期诊断和预防。有研究表明,人参的活性成分人参总皂苷(Ginseng Total Saponins,GS)能有效地改善血流动力学,抑制心室重构的进行,从而保护心功能。黄连的活性成分黄连小檗碱(Berberine,Ber)既可抗心律失常,又对心衰的发生和心肌的能量代谢有良好的保护作用。两种中药的有效成分对血浆BNP水平和心肌细胞内钙离子浓度都有影响,而“人参、黄连”又为中医里面比较经典的药对之一,很多研究都致力于此积极探讨这两种中药活性成分防治心衰的机理。但大多数结合中药调控Ca2+研究心衰疾病都是基于细胞释放Ca2+到血浆后,研究血浆中Ca2+浓度反应心肌细胞内Ca2+浓度与心衰相关性。因而,在细胞层面原位监测研究中药调控心肌细胞Ca2+的释放,有助于现代中药防治心衰机制的研究。近年来随着纳米科学与界面科学的蓬勃发展,基于纳米材料的第三代场效应晶体管(Field Effect Transistor,FET)生物传感器引起了世人极大关注,其研究涉及到生物、信息、物理、化学等多个重要领域,对临床检测、遗传分析、环境检测、生物反恐和国家安防等多个领域产生了革命性的影响,因而成为国际上的研究前沿和热点。利用fet灵敏度高、分析速度快、试剂消耗少、操作简单、免标记、本身就具有信号放大功能的特点与纳米材料比表面积大、吸附能力强、催化效率高、表面活性位点多等优势结合,在实际应用方面空间广阔。特别是石墨烯在众多纳米材料中表现出了更为优异的理化性质,有极好的热电传导性、高机械强度和生物相容性,在构建生物传感器,检测生物分子方面具有得天独厚的电学优势。因而基于石墨烯的fet生物传感新方法可以为心衰疾病的检测提供新方法。本论文拟构建一种新型场效应晶体管生物传感器——铂纳米颗粒(platinumnanoparticles,ptnps)修饰的还原氧化石墨烯(rgo)fet生物传感器,集成微过滤系统,用于全血中心衰标志物bnp的高灵敏、高特异性快速检测;另外,构建了基于还原氧化石墨烯/二氧化钛(rgo/tio2)功能化的场效应晶体管生物传感器在细胞水平原位监测细胞ca2+的释放,从而了解细胞内外ca2+浓度的变化,并探索有效的方法实现传感器的再生;最后,将该传感器用于研究中药活性成分人参总皂苷合黄连小檗碱对心肌细胞ca2+释放的影响,为探讨中药配伍对心衰疾病的治疗机理提供理论和技术支持。第一部分:铂纳米颗粒/石墨烯功能化场效应晶体管生物传感器全血中检测bnp。首先利用光刻技术和电子束蒸发镀膜技术在硅片上用图案掩膜法沉积50nm厚度的金电极,制备成晶体管芯片。在传统的hummer制备方法上改进合成了氧化石墨烯(go),合成的go在水合肼的作用下还原生成还原氧化石墨烯(rgo)。在传感沟道中利用滴涂法沉积rgo作为导电沟道,然后在rgo界面用紫外光照还原na2ptcl4的方法沉积ptnps,制备成ptnps/rgofet生物传感器。将bnp抗体蛋白分子通过pt-s键固定在铂纳米颗粒表面,当全血样本中有bnp存在时,通过抗原-抗体结合,bnp就可以结合到传感表面。由于bnp带电荷,bnp结合前后会导致石墨烯表面载流子浓度的变化和电荷的结构重排,从而诱导转移特性曲线中狄拉克点的变化。通过检测传感器电流变化就可以监测全血中bnp量的变化。然后与传统的过滤系统集成一体,可以快速检测人血实际样本。实验结果表明,该方法检测范围为:100fm~1nm,线性方程为:?i(na)=-10.43lgcbnp(m)-140.40,检出限为100fm。为了实现全血中bnp的直接检测,用微过滤器处理全血样本得到血清样本,将该生物传感器实施血清中bnp的检测,发现随着血液中bnp浓度增加,信号响应增大,表明该ptnps/rgofet生物传感器集成微过滤系统装置可实现血液样本中心衰标志物的检测。第二部分:基于二氧化钛/石墨烯功能化场效应晶体管生物传感器原位监测细胞释放ca2+。根据文献制备石墨烯与二氧化钛(tio2)的复合物rgo/tio2纳米材料,在已构建的rgofet传感界面将rgo/tio2复合物滴涂在芯片的传感区域,构建三明治夹心结构的rgo/tio2/rgofet传感器。然后将ca2+探针分子fluo4-am通过π-π堆积的方式固定在石墨烯传感界面上,由于ca2+带正电荷,利用探针分子与靶标分析物结合时电荷由4e变化为2e的电学特性,促进导电沟道表面传导电荷分布的变化,从而引起rgo/tio2/rgofet生物传感器电学性能变化,实现溶液中ca2+浓度的监测。用该传感器分别在pbs和fbs体系中实施了ca2+的实时监测。研究结果表明,随着ca2+浓度的增加,电流信号变小。在pbs溶液中,在100pm~1mm浓度范围内呈线性相关性,线性方程为:?i(na)=36.97lgc(m)+363.08,检出限为100pm。在fbs溶液中,在1nm~1mm浓度范围内呈线性相关性,线性方程为:?i(na)=32.49lgc(m)+332.43,检出限为1nm。将该fluo4-am功能化的rgo/tio2/rgofet生物传感器用于人脐静脉内皮细胞(huvec)的ca2+释放监测实验中,将细胞培养在传感芯片表面,在高钾刺激剂刺激细胞后,细胞会释放出ca2+,从而引起传感器电流信号的下降,说明该传感器能实现细胞Ca2+释放的原位监测。由于TiO2纳米颗粒是一种光敏材料,具有光催化自清洁作用,该传感器在强紫外光照射下,产生活性氧自由基降解有机生物分子,使传感界面的细胞和探针分子降解,实现传感器的再生功能。第三部分:人参总皂苷合黄连小檗碱调控心肌细胞钙离子释放的监测利用Fluo 4-AM功能化的RGO FET生物传感器监测两种中药人参和黄连的活性成分GS和Ber调控心肌细胞Ca2+释放。实验选择了Ber、GS、GS+Ber三组药物与无血清培养基对心肌细胞孵育,利用构建的Fluo 4-AM功能化的RGO FET生物传感器分别监测三组中药孵育后心肌细胞Ca2+释放,以电学信号下降百分比衡量Ca2+浓度的变化,结果发现Ber、GS和GS+Ber分别致使细胞内Ca2+浓度下降22.4%、27.1%和41.5%。说明Ber、GS和GS+Ber三组药物孵育的心肌细胞内Ca2+浓度均有减小。因为这三组药物对心肌细胞内Ca2+浓度都有抑制作用,促使胞内Ca2+浓度减小,在高钾刺激剂刺激细胞时Ca2+释放量也相应减小。由于Ber可以通过降低心肌细胞内游离Ca2+浓度而起到改善心脏舒张功能的作用,而GS可以保护心肌细胞中线粒体钙泵活性,保护膜系统完整,降低细胞内游离Ca2+浓度,防止心肌细胞内钙超负荷。两者共同作用时对心肌细胞内钙超载有更好的改善作用。该结果说明Fluo 4-AM功能化的RGO FET生物传感器能有效的应用于中药调控心肌细胞Ca2+释放原位监测,为心衰疾病的中药治疗药效评估提供新方法。