1、研究背景对肿瘤发生和发展中细胞信号通路内蛋白的变化进行阐明,是帮助我们找到有效的预防和治疗肿瘤方法的积极方式。肝癌(主要是hepatocellular carcinoma, HCC)在最近的几十年内,排在当今世界最常见肿瘤中的第五位,此外已成为因癌致死的第三位。在中国肝癌的发病率与全世界的肝癌发病率相比较已高于55%。目前在中国由癌症引起的死亡中,肝癌排在第二位,占全部肿瘤的19.33%。多年来尽管生物医学和临床医疗工作者致力于攻克肝癌这顽疾,但进展甚微。目前手术治疗是比较有效的手段,但大部分肝癌病人被诊断发现时都已到了癌症的晚期(大部分都已经转移),外科切除的方法已经不再适合,而系统性的化学治疗通常成为唯一可尝试的治疗手段。发现新型肝癌药物治疗的靶标,不仅可以揭示新的信号通路在肝癌的发生和发展中的作用,而且为临床肝癌的药物治疗提供有效的靶标。抗肿瘤药物的开发是新药研究的方向之一,而天然产物具有来源广泛,结构多样以及药理作用独特的特点,经过长期的临床应用,大多数疗效确切,使用安全性高。在目前的临床应用药物中,有将近50%是来自天然产物及其衍生物。例如：氧代(?)酮类天然产物目前发现具备多种药理学活性,包括：抗炎、抑菌、抗肿瘤、心脑血管及免疫系统调节等。因此,从天然产物中寻找结构和功能的多样性高、成药性好、资源丰富易得的天然活性小分子已成为药物研究的热点。蛋白激酶C(protein kinase C, PKC)是G蛋白偶联受体(GPCR)及各种生长因子受体信号通路内的一类必不可少的蛋白分子。根据它们的结构和功能分为三组：第一组为典型或传统的PKC (classical or conventional PKC, cPKC),包括α,βⅠ、βⅡ和Y亚类；第二组为新型PKC(novel PKC, nPKC),包括δ、ε、η、θ和μ亚类；第三组为非典型PKC (atypical PKC, aPKC),由ζ和λ/l亚类组成。每一种PKC亚型通过对其信号通路中特定的下游分子产生独特的作用,导致它们对肿瘤的发生,进展和转移产生或正面、或负面的影响,很多报道表明PKC某些亚基的过表达与肿瘤(包含肝癌)的发生以及进展高度相关。抑制PKC从细胞浆到细胞膜的转位,从而抑制其下游分子的磷酸化,或许为肝癌的治疗提供了一个思路。目前发现的PKC抑制剂因亚基选择性的缺乏,导致其在临床应用中表现出明显的毒副作用。因此,迫切需要找到化合物兼备特异性高和选择性好。在研发有治疗效果的抗肿瘤药物时,从自然界容易获得的天然产物中寻找,不失为一种优选的策略。当前报道显示,(?)酮类化合物在抗肿瘤功效方面潜能巨大。因此,本课题将在细胞模型和动物模型中引入抑制PKC活性及表达的氧代(?)酮类天然小分子化合物,通过其对肝癌细胞和移植瘤的抑制作用,检测凋亡,迁移及侵袭等指标变化,明确其PKC亚基的选择性,为临床上肝癌治疗过程中的药物设计提供一定的科学依据以及先导化合物。2、研究方法(1)利用细胞毒性检测实验,在人肝癌细胞株中筛选出具备潜在的有抗肿瘤活性的(?)酮类化合物。在细胞水平评价这些有抗肿瘤活性的化合物是否对肿瘤细胞的迁移、侵袭及增殖有抑制效力。(2)筛选能够短期在裸鼠皮下形成移植瘤的人肝癌细胞系。能够被最终用于体内实验的人肝癌细胞系需具有细胞增殖快；具有明显的在体外迁移及侵袭的活性；具有在裸鼠皮下能短时间内迅速成瘤等恶性肿瘤细胞所应具备的特性。(3)将人肝癌细胞注射到BALB/c裸鼠的皮下诱发肿瘤(移植瘤),通过尾静脉注射经体外筛选具有对抗肿瘤增殖的(?)酮类小分子化合物,检测肿瘤在裸鼠体内的生长及转移情况,并对肿瘤组织进行免疫组化分析、H&E检测凋亡以及免疫印迹等分析。(4)通过蛋白激酶活性分析,发现靶向PKC有活性抑制能力的小分子化合物,敲定重点研究对象。(5)由于每一种PKC亚型可通过其信号通路中特定的下游分子产生独特的生物作用。靶向PKC亚型,进一步研究具备PKC抑制活性的小分子化合物是否对PKC亚基的表达能够选择性下调,是否与PKC亚基有结合能力。同时检测小分子化合物对PKC下游与人肝癌细胞的凋亡、迁移及侵袭相关蛋白的影响。3、研究结果(1)对氧代(?)酮类小分子化合物进行CCK-8细胞毒性筛选,经过终浓度50μM的初筛和浓度梯度复筛,发现天然产物异巴西红厚壳素(Isojacareubin, ISJ)及其中间体化合物7 (7,9-dihydroxy-2,2-diphenyl-6H-[1,3]dioxolo[4,5-c]xanthen-6-one)具备抗肝癌活性及选择性,即细胞毒性只针对肝癌细胞而并不针对正常肝细胞。进一步通过流式细胞仪检测凋亡细胞发现,ISJ及其中间体化合物7能够以剂量依赖的方式促进肝癌细胞HepG2凋亡,抑制其迁移及侵袭。(2)利用细胞划痕实验、transwell细胞侵袭实验以及异种移植瘤成瘤实验,肝癌细胞HepG2被发现具有细胞增殖快；显著的体外迁移、侵袭活性；在裸鼠皮下能迅速成瘤等恶性生物学特性。(3)天然产物ISJ的体内抗肿瘤活性被进一步评估,在裸鼠的右侧背部的皮下注射5×106个肝癌细胞HepG2/只,当肿瘤体积达到75-100 mm3时,通过尾静脉按照5mg/kg体重的剂量连续隔天给药14天。与对照组相比,结果发现5mg/kg的给药组能够显著抑制移植瘤的生长,并且给药组的小鼠体重无显著降低,说明药物无显著的毒副作用。H&E染色镜下显示给药组的肿瘤组织有明显的粥样坏死。此外,我们用免疫组化和免疫印迹的方法考察给药组肿瘤组织中相关蛋白的变化情况,结果发现凋亡相关蛋白c-PARP、c-Caspase 3和c-Caspase 9的表达量显著上升。(4)对氧代(?)酮类小分子化合物进行PKC酶的活性筛选后发现,ISJ及其中间体化合物7拥有PKC的抑制活性,尤其ISJ在5 μM时能够显著抑制PKC活性。(5)通过免疫印迹试验即western blot及pull down实验对天然产物ISJ进行亚基选择性分析,结果发现ISJ选择性抑制aPKC (PKCζ)在细胞浆的表达,并抑制aPKC (PKCζ)的活化即从胞浆转位至胞膜；同时,ISJ又可与cPKC (PKC α)或nPKC (PKC δ, PKCε和PKCμ)产生结合作用。(6)ISJ对PKC不同亚基的表达抑制效应和结合作用,直接导致了早期表现：ISJ抑制了肝癌细胞PKC下游的Raf/MAPK信号通路内相关蛋白激酶的磷酸化；晚期表现：ISJ抑制了肝癌细胞HepG2的恶性迁移、侵袭,以及与肝癌细胞HepG2恶性侵袭相关的蛋白表达被下调,与凋亡相关蛋白的表达被上调。4、结论本课题合成并生物评估了一类新颖的以氧代(?)酮结构为基础的PKC抑制剂。其中尤以天然产物ISJ,因其显著的体外抗肝癌增殖活性、促肝癌细胞HepG2凋亡效应和影响肝癌细胞HepG2的迁移、侵袭,而被重点研究。此外,我们发现ISJ具备更好的PKC抑制活性。因此,在众多氧代(?)酮类化合物中,天然产物ISJ被用于进行深层次的机制研究,结果表明靶向不同的PKC亚基,ISJ展现出不同的作用机制。ISJ选择性地抑制aPKC(PKCζ)在细胞浆的表达,并抑制aPKC(PKCζ)的转位即从胞浆到胞膜；同时,ISJ又可与cPKC(PKC α)或nPKC(PKC δ, PKCε和PKCμ)产生结合作用。该表达抑制效应及结合作用,直接导致了早期表现：ISJ抑制了肝癌细胞PKC下游的Raf/MAPK信号通路内相关蛋白激酶的磷酸化；晚期表现：ISJ抑制肝癌细胞HepG2的侵袭和增殖。此外,在肝癌异种移植瘤模型中,ISJ表现出显著的体内抗肿瘤活性。综上所述,本研究发现了一种新颖的以氧代(?)酮结构为基础的PKC抑制剂ISJ,可用于肝癌的治疗。