【摘 要】
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rol基因被作为提高植物次生代谢的靶基因被广泛研究,其中rolB和rolC基因作为rol基因家族中的强效靶基因,在不同植物中促进效果也各有差异,因此,不同的植物存在不同的主效rol基因,而且不同rol基因之间也存在一定的相互影响。本研究以颠茄（Atropa belladonna L.）为实验材料,构建超表达rolB基因和共表达rolB和rolC基因的植物表达载体,通过遗传转化获得转基因颠茄,再结合
【基金项目】
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贵州大学引进人才科研项目“rol基因遗传改造的抗胆碱药药源颠茄分子育种研究”（贵大人基合字（2017）58号）； 生物学一流学科开放基金“黔产钩藤中活性成分合成关键基因STR的筛选鉴定与转基因研究”（GNYL[2017]009FX1KT12）； 青年教师国家自然科学基金“rol基因根定位表达调控托品烷生物碱合成的分子机理”（贵大培
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rol基因被作为提高植物次生代谢的靶基因被广泛研究,其中rolB和rolC基因作为rol基因家族中的强效靶基因,在不同植物中促进效果也各有差异,因此,不同的植物存在不同的主效rol基因,而且不同rol基因之间也存在一定的相互影响。本研究以颠茄（Atropa belladonna L.）为实验材料,构建超表达rolB基因和共表达rolB和rolC基因的植物表达载体,通过遗传转化获得转基因颠茄,再结合实验室前期获得的超表达rolC基因的p BI121-rolC颠茄,通过分析3种转基因颠茄的园艺性状、托品烷生物碱（tropane alkaloids,TAs）含量、TAs合成途径基因表达量以及H2O2和NO含量,以此探究rolB和rolC基因对颠茄TAs含量的影响以及rolB和rolC基因之间的相互影响,为探究rol基因调控次生代谢产物的合成机制奠定基础,也为进一步研究促进颠茄托品烷类生物碱的合成代谢工程提供一种新方法。研究结果如下:（1）超表达rolB、rolC基因植株的建立和分子检测:本研究构建了超表达rolB基因的植物表达载体p BI121-rolB和共表达rolB和rolC基因的植物表达载体p1305NKB+121C,并通过农杆菌侵染颠茄子叶及下胚轴,获得了超表达rolB基因的p BI121-rolB颠茄和共表达rolB和rolC基因的p1305NKB+121C颠茄,再结合实验室前期获得的超表达rolC基因的p BI121-rolC颠茄作为后续研究材料。（2）rol基因对颠茄园艺性状的影响:p BI121-rolB颠茄呈现叶片呈深绿色、叶片面积增加、花型增大且偏向坛形花冠、雌蕊高度降低、花粉可育但活力下降、根系发达、茂密等表型;p BI121-rolC颠茄呈现顶端优势下降、开花时间提前、花朵数量增多、花形变小、花粉不可育、腋芽茂盛、节间缩短、叶片呈浅绿色且为狭长叶、根系发达等表型;P1305NKB+121C颠茄表型更偏向p BI121-rolC颠茄,但花形、叶片、株高更小,分支数、叶片数更多,根系提前衰老,其余表型与p BI121-rolC颠茄一致。园艺性状分析结果表明,外源引入rolB和rolC基因均会造成颠茄植株地上部分和地下部分发育变异。（3）rol基因对颠茄中TAs含量的影响:p BI121-rolB颠茄茎中东莨菪碱、山莨菪碱和莨菪碱含量分别提高了1.44～1.86倍、1.49～2.87倍和4.49～4.77倍,而叶中的生物碱含量与野生型颠茄相比无显著差异。p BI121-rolB颠茄叶中东莨菪碱、山莨菪碱和莨菪碱含量分别提高了1.54～2.70倍、1.90～2.93倍和1.44～1.73倍,而在茎中仅有C-1株系TAs含量显著高于对照,其含量分别提高了3.65、4.66和6.35倍。而p1305NKB+121C颠茄叶中TAs含量与野生型颠茄无显著差异,茎中除BC-2株系外,其余株系与野生型也无显著性差异。BC-2株系的东莨菪碱、山莨菪碱和莨菪碱含量分别提高了2.5倍、3.39倍和5.04倍。分析结果表明,rolB和rolC基因均会增加颠茄中TAs含量。rolB基因主要促进了颠茄茎中TAs的积累,而rolC基因主要促进了颠茄叶中TAs的积累,且rolC基因的促进作用整体大于rolB基因,但rolB和rolC基因同时作用对颠茄TAs含量提高不显著。因此,rolC基因为颠茄的主效基因,且rolB基因的引入在一定程度上削弱了rolC基因对颠茄TAs含量的促进作用。（4）TAs合成途径基因表达量分析:在p BI121-rolB颠茄和p BI121-rolC颠茄根系中TAs合成途径基因UGTⅠ和H6H表达量显著上调,TRⅡ表达量显著下调。在p BI121-rolB颠茄中UGTⅠ和H6H表达量分别上调14.30和11.80倍,而TRⅡ表达量下调5.71倍。在p BI121-rolC颠茄中UGTⅠ和H6H分别上调55.63和11.53倍,而TRⅡ表达量下调7.35倍。在p1305NKB+121C颠茄各株系中UGTⅠ、H6H和TRⅡ表达量均不一致。分析结果表明,rolB和rolC基因主要是通过上调UGTⅠ和H6H表达水平和下调TRⅡ表达水平从而提高颠茄TAs含量。（5）颠茄中H2O2和NO含量分析:本研究为了探究rol基因调控TAs积累的机制,检测了3种转基因颠茄中的H2O2和NO含量。发现rolB基因和rolC基因的引入并不会导致颠茄中H2O2和NO含量发生显著变化。因此,分析结果表明,rolB基因和rolC基因并未通过H2O2和NO作为信号分子以此提高颠茄中的TAs含量。综上所述,单独引入或共同引入rolB和rolC基因均会造成颠茄地上和地下部分发育变异,但单独引入rolB和rolC基因可上调UGTⅠ和H6H基因表达水平以及下调TRⅡ基因表达水平,从而提高颠茄TAs含量。虽然rolB和rolC基因均能够提高颠茄中TAs含量,但rolC基因对颠茄中的TAs合成促进作用更为显著,因此,rolC基因为颠茄的主效rol基因且rolB和rolC基因之间呈拮抗作用。rolB和rolC基因也并未通过ROS和NO介导TAs的合成。
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