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二苯乙烯苷(2,3,5,4’-tetrahydroxystilbene-2-O-β-D-glucoside, THSG)是何首乌(Polygonum multiflorum Thunb.)的主要有效成分,具有抗炎、抗氧化、调节血脂、抗肿瘤、安神、预防和治疗阿尔茨海默症作用。目前二苯乙烯苷研究集中在提取和药理方面,对二苯乙烯苷的生物合成路径未见报道,因此二苯乙烯苷的合成路经值得研究。首先获得何首乌愈伤组织,然后建立何首乌悬浮细胞系。利用普通前体饲喂和稳定同位素前体示踪何首乌悬浮细胞,通过HPLC-MS/MS进行检测,根据检测结果推测二苯乙烯苷生物合成路径。本文主要研究结果如下:(1)通过正交实验获得何首乌愈伤组织的诱导培养基:含有1mg·L-12,4-D和0.4mg·L-1NAA的MS培养基。在此培养基中,15天就能诱导出愈伤组织,愈伤组织的诱导率为96.7%。检测了何首乌根、茎、叶的愈伤组织诱导效果和二苯乙烯苷的含量,发现何首乌根、茎和叶都能诱导出愈伤组织,其中根诱导出的愈伤组织中二苯乙烯苷含量最高,为1.5mg·g-1,因此选择二苯乙烯苷含量高的根愈伤组织进行培养。何首乌愈伤组织比较致密,不能进行悬浮细胞培养。通过把何首乌愈伤组织接入液体MS培养基中培养4天,然后转接到含有不同植物生长激素的固体MS培养基中进行培养,获得了疏松易碎的愈伤组织,通过实验获得适合何首乌疏松愈伤组织生长的植物生长激素配比:0.2mg·L-16-BA和0.5mg·L-1NAA。(2)比较了何首乌在MS、B5和N6培养基生长的效果,发现MS培养基是何首乌液体最佳生长培养基,在此培养基中生长的细胞干重和二苯乙烯苷含量分别为6.35g·L-1和42.23mg·L-1,因此选择MS培养基作为何首乌悬浮培养基。(3)通过把悬浮细胞铺在平板上,培养30天后,挑选生长快的小细胞团转接到新的平板继续培养,然后每隔15天转接一次,共转接6次,检测不同细胞团的二苯乙烯苷含量,最终获得高含量二苯乙烯苷的细胞系,此高含量何首乌悬浮细胞的干重和二苯乙烯苷的含量分别达到7.46g·L-1DW和56.23mg·L-1,而原细胞系悬浮细胞的干重和二苯乙烯苷含量分别6.55g·L-1DW和43.39mg·L-1,此高含量细胞系悬浮培养干重比原细胞系提高了13.89%,二苯乙烯苷含量比原细胞系提高了29.59%。通过发酵条件优化,获得何首乌悬浮细胞系最佳的培养条件为100rpm、26℃暗培养16天。(4)为了筛选二苯乙烯苷合成路径的前体和饲喂研究,在何首乌悬浮细胞培养的第10天,在何首乌悬浮细胞MS培养基中分别加入不同浓度的苯丙氨酸,发现添加60mg·L-1的苯丙氨酸时何首乌悬浮细胞中二苯乙烯苷含量最高,达到105.15mg·L-1,比没有加苯丙氨酸的对照组(55.23mg·L-1)增加了90.38%,这说明苯丙氨酸能增加二苯乙烯苷含量,可能是二苯乙烯苷的前体。在何首乌悬浮细胞培养基中分别加入不同浓度的肉桂酸,发现添加40mg·L-1的肉桂酸时何首乌悬浮细胞达到最大二苯乙烯苷含量:123.03mg·L-1,比没有加肉桂酸的对照组(55.23mg·L-1)增加了122.76%,这说明肉桂酸能增加二苯乙烯苷含量,可能是二苯乙烯苷的前体。在何首乌悬浮细胞培养基中分别加入不同浓度的乙酸钠,发现添加20mg·L-1的乙酸钠,何首乌悬浮细胞能达到最大二苯乙烯苷含量:89.08mg·L-1,比没有加乙酸钠的对照组(55.23mg·L-1)增加了61.29%,这说明乙酸钠能增加二苯乙烯苷含量,可能是二苯乙烯苷的前体。在液体MS培养基中分别加入不同浓度苯丙氨酸、肉桂酸和乙酸钠的混合前体,发现添加40mg·L-1的肉桂酸和20mg·L-1乙酸钠,何首乌悬浮细胞二苯乙烯苷含量最大:162.65mg·L-1,比对照组(55.23mg·L-1)增加了194.50%,说明混合前体效果最好。(5)在何首乌液体MS培养基中加入U-13C9苯丙氨酸示踪,通过HPLC-MS/MS检测,13C标记的苯丙氨酸能结合进入二苯乙烯苷,这确证了苯丙氨酸是二苯乙烯苷的前体。在何首乌液体MS培养基中加入U-13C9肉桂酸示踪,通过HPLC-MS/MS检测,13C标记的肉桂酸能结合进入二苯乙烯苷,这确证了肉桂酸也是二苯乙烯苷的前体,并且示踪实验证明了我们假定的二苯乙烯苷合成路径。根据以上结论,我们证明了何首乌二苯乙烯苷的生物合成路径:苯丙氨酸作为前体,在苯丙氨酸解氨作用下合成肉桂酸,再经过几步反应合成二苯乙烯苷。