论文部分内容阅读
肺癌、乳腺癌及前列腺癌等恶性肿瘤在晚期时常发生骨转移。将会导致患者剧烈性骨痛、病理性骨折、截瘫、高钙血症和神经压迫等一系列骨相关不良事件(skeletal related events,SRE)的发生,并最终导致患者死亡。然而肺癌出现骨转移的重要原因之一就是肿瘤微环境与肺癌细胞发生一系列功能性相互作用。因此,人为切断这一相互作用将会是一种很有效的治疗策略,从而可以设计出具有针对性的肺癌骨转移治疗方法。骨基质中含有多种生长因子和趋化因子,如TGF-β、FGF、IGF、CXCL12、CCL22等,其中转化生长因子β(transforming growth factor,TGF-β)是骨基质中含量最多的细胞因子之一。TGF-β是一种具有多种功能的多肽类细胞因子,能够调节促进肿瘤发生骨转移的相关基因的表达,有文献表明其中TGF-β信号通路负性调控因子PMEPA1在肿瘤细胞EMT化过程中发挥重要作用,而在构建前列腺癌骨转移模型时发现抑制TGF-β信号通路能够抑制前列腺癌出现骨转移。为探究PMEPA1基因在肺癌骨转移过程中发挥的作用,本研究选取两种肺癌细胞株作为研究对象,分别是NCI-H292和A549。通过干扰PMEPA1基因表达的前后,TGF-β对于两株肺癌细胞侵袭、迁移能力及相关基因和蛋白表达的变化,初步探讨PMEPA1基因在肺癌骨转移中的作用和机制。目的以肺癌细胞株NCI-H292和A549为研究对象,在干扰PMEPA1基因表达的前后,采用外源性TGF-β处理两株肺癌细胞,检测细胞侵袭、转移能力及相关基因、蛋白表达的变化情况,初步探讨PMEPA1基因在肺癌骨转移中的作用和机制。方法1.用外源性TGF-β处理两株肺癌细胞株后,荧光定量PCR法和免疫印迹western法分别检测两株细胞转移与侵袭相关的基因和蛋白,即PTHr P、MMP2、VEGF、IL-11、ADAM-19表达变化程度。2.采用Transwell和划痕实验分别检测外源性TGF-β对两株细胞的迁移和侵袭能力的影响。3.用小干扰RNA即siRNA干扰肺癌细胞PMEPA1的表达后,再用TGF-β刺激肿瘤细胞。4.通过荧光定量PCR和免疫印迹法分别检测转染后细胞与骨转移相关的基因和蛋白的变化程度。5.通过Transwell和划痕实验检测转染后细胞迁移和侵袭能力的变化。结果1.划痕实验显示:作用12h,TGF-β刺激组与空白对照组相比,A549迁移距离比率为(181.53±11.34)%,H292迁移距离比率为(187.14±17.45)%。作用24h,A549迁移比率为(177.32±8.14)%,H292迁移距离比率为(193.79±10.66)%。在转染siRNA-PMEAPA1和siRNA-NC后,12h A549迁移距离比率分别为(190.50±10.76)%、(283.10±33.00)%,H292迁移距离比率分别为(177.21±28.71)%、(279.24±16.61)%,作用24h后,A549迁移距离比率分别为(201.67±35.12)%、(275.46±22.15)%,H292迁移距离比率分别为(162.05±12.53)%、(266.44±18.34)%。2.Transwell侵袭实验显示:TGF-β刺激前后穿膜细胞数分别为:A549(34±6.5)、(81±9.5);H202(52±7.5)、(122±6.1);转染siRNA后,siRNA-NC和siRNA-PMEPA1分别为:A549(82±5.0)、(162±7.85);H292(115±8.83)、(207±10.56)。3.荧光定量PCR实验显示:TGF-β刺激后各基因相对对照组的变化量%TGF-β刺激后各基因相对对照组的变化量%4.蛋白免疫印迹结果显示:TGF-β刺激后,PTHRP、MMP-2、PMEPA1蛋白表达量分别为:TGF-β刺激后各蛋白相对内参的变化量%TGF-β刺激后各蛋白相对内参的变化量%结论1.TGF-β能够上调肺癌细胞PEMEPA1和一系列与骨转移相关的基因和蛋白的表达,TGF-β受体抑制剂SD208可以抑制这一促进效应。2.TGF-β能够促进肺癌细胞的转移与侵袭能力,SD208能够抑制这一促进效应。3.TGF-β负性调控因子PEMPA1能够通过抑制TGF-β信号通路抑制肺癌与骨转移相关的基因与蛋白的表达,从而抑制肺腺癌向骨组织侵袭与转移。