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目的:p21激活激酶（p-21 activated kinases，PAKs）是一类进化上高度保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，为Rho家族小鸟苷三磷酸酶(Rho-GTPase)Cdc42/Rac1的下游主要靶蛋白，迄今为止PAK家族共发现6个成员，根据其结构相似性，调节机制及功能将它们分为两类，Ⅰ类包括PAK1-3，Ⅱ类包括PAK4-6。PAK4作为Ⅱ类PAK的代表性成员，在多种细胞组织中广泛表达，参与许多重要的细胞活动，如保护细胞抑制凋亡、促进细胞迁移和细胞锚定非依赖性生长等。并且PAK4作为信号转导通路的枢纽，在肿瘤的发生和发展及侵袭转移中都发挥重要作用。此外，在大多数肿瘤细胞系和恶性肿瘤组织中都存在PAK4的高表达或者遗传性扩增。本课题组的前期研究表明，PAK4在人胃癌组织及多种人胃癌细胞系中表达异常增高。 葡萄糖是正常组织细胞最重要的能源，在细胞内有两条主要的产能途径:糖酵解和有氧氧化。正常细胞通常以有氧氧化来供能，只有在氧气供应不足的条件下以糖酵解供能，糖酵解是一条低效的产能途径，因此在正常细胞内有氧氧化通常抑制糖酵解，称为巴斯德效应。大约在80年前Warburg首先发现肿瘤细胞即使在有氧的条件下也主要依赖糖酵解供能，这是肿瘤细胞的一个代谢特性被称为Warburg效应或有氧糖酵解。糖酵解的代谢过程是将葡萄糖经6-磷酸葡萄糖等一系列转变最后生成乳酸。磷酸戊糖途径是糖酵解的一个支路，是从6-磷酸葡萄糖开始经一系列代谢转变，又回到糖酵解途径。该支路最重要的生理意义是产生两个重要的中间产物:还原当量NADPH和5-磷酸核糖，NADPH在体内用于脂酸和胆固醇等物质的还原性合成;5-磷酸核糖是DNA和RNA合成的原料。6-磷酸葡萄糖脱氢酶（Glucose-6-phosphate dehydrogenase，G6PD）是该途径的关键酶，由管家基因编码，在乳腺癌、子宫内膜癌、前列腺癌、肺癌、宫颈癌中都可见到G6PD的异常表达。G6PD在NIH3T3细胞的异位表达明显地提高了NADPH的水平，促进了细胞锚定非依赖性生长，这些都提示G6PD是一个癌基因。已有研究证实抑癌基因p53在调节肿瘤细胞糖代谢中发挥重要作用。 本研究首先采用GC-MS法筛选沉默PAK4后的差异代谢物，在蛋白相互作用的基础上探讨PAK4与G6PD通路之间的对话，及它们对结肠癌细胞代谢及生长的影响，为明确结肠癌发生发展的分子机制提供新的实验依据。 研究方法: 1、GST-pull down实验鉴定PAK4与G6PD在体外的相互作用。 2、免疫共沉淀实验证实PAK4与G6PD在细胞内的相互作用。 3、共聚焦激光扫描显微镜观察PAK4与G6PD的定位及共定位。 4、NADPH试剂盒检测PAK4对细胞内NADPH含量的影响。 5、葡萄糖试剂盒检测PAK4对葡萄糖消耗的影响。 6、利用Western Blot方法检测PAK4对G6PD的蛋白表达水平的影响。 7、分光光度法检测PAK4对G6PD活性的影响。 8、气相色谱与质谱联用法检测PAK4对细胞内糖、脂及其他代谢物含量的影响。 9、生长曲线法检测PAK4对结肠癌细胞生长的影响。 10、利用Western Blot方法和X2检验分析方法证实PAK4和G6PD在结肠癌组织样本中存在正相关性。 11、免疫组织化学方法、非参数检验方法和Mann-Whitney U-test分析方法证实PAK4和G6PD与结肠癌病理特征的关系。 12、体外激酶实验分析检测PAK4对G6PD的磷酸化情况。 13、GST-pull down实验鉴定PAK4与P53在体外的相互作用。 14、免疫共沉淀实验证实PAK4与P53在细胞内的相互作用。 15、免疫共沉淀实验检测PAK4与P53竞争和G6PD的结合。 16、Western Blot检测PAK4对P53和MDM2蛋白表达水平的影响。 17、免疫共沉淀实验证实PAK4促进P53的泛素化降解。 18、免疫共沉淀实验证实PAK4与MDM2在细胞内的相互作用。 19、免疫共沉淀实验证实PAK4促进P53和MDM2的结合。 20、在HCT116p53-/-细胞中采用NADPH试剂盒检测PAK4对细胞内NADPH含量的影响。 21、在HCT116p53-/-细胞中采用葡萄糖试剂盒检测PAK4对葡萄糖消耗的影响。 结果: 1、PAK4与G6PD能够在体外直接结合。 2、PAK4与G6PD能够在结肠癌细胞HCT116 p53+/+内相互作用。 3、PAK4与G6PD能够在结肠癌细胞HCT116 p53+/+细胞质中共定位。 4、在HCT116p53+/+细胞中PAK4促进了NADPH的生成。 5、在HCT116p53+/+细胞中PAK4促进了葡萄糖的消耗。 6、在HCT116p53+/+细胞中PAK4对G6PD的蛋白表达水平几乎没有影响。 7、在HCT116p53+/+细胞中PAK4提高了G6PD的活性。 8、在HCT116p53+/+细胞中PAK4促进了软脂酸、胆固醇、各种氨基酸及其他代谢物的生成。 9、在HCT116p53+/+细胞中，PAK4促进了细胞的生长。 10、PAK4和G6PD在结肠癌组织中的蛋白表达呈正相关。 11、PAK4和G6PD与结肠癌的TNM分期密切相关。 12、PAK4不能磷酸化G6PD. 13、PAK4与P53能够在体外直接结合。 14、PAK4与P53能够在HCT116 p53+/+细胞内存在相互作用。 15、PAK4不影响P53和G6PD的结合。 16、在HCT116p53+/+中PAK4下调p53的蛋白表达水平。 17、在HCT116p53+/+中PAK4促进了p53的泛素化降解。 18、PAK4与泛素蛋白连接酶E3(MDM2)能够在HCT116 p53+/+细胞内相互作用。 19、PAK4上调泛素蛋白连接酶E3(MDM2)的表达。 20、PAK4促进E3泛素连接酶(MDM2)与P53的结合。 21、在HCT116p53-/-细胞中PAK4对NADPH的生成没有明显影响 22、在HCT116p53-/-细胞中PAK4对葡萄糖的消耗没有明显影响。 结论:1、PAK4促进了结肠癌HCT116p53+/+细胞葡萄糖的消耗，NADPH的生成，提高了G6PD的活性，促进了结肠癌细胞的脂肪酸、胆固醇和其他代谢物的生成，进而促进了结肠癌细胞的生长。2、PAK4通过提高了MDM2的表达，促进MDM2与P53的结合，从而促进P53的泛素化降解，提高了G6PD的活性，进而促进了结肠癌细胞的糖代谢和细胞的生长。