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目标:由于生活方式和膳食习惯的改变,近年来我国结直肠癌患者的发病率、死亡率持续上升,结直肠癌发病率在中国仅次于胃癌、肺癌和食道癌,居第四位;在全世界结直肠癌的发病率、死亡率居人类恶性肿瘤的前三位。髓系细胞在维持肠道免疫系统稳定、调节结肠炎乃至结直肠癌发生上具有重要作用。髓系细胞TGF-β途径通过产生更多的促炎因子和招募更多的巨噬细胞有助于肠炎以及结肠炎相关结直肠癌(colitis-associated cancer,CAC)的发生;髓系细胞敲除COX-2和αv整合素使小鼠结肠炎加重;髓系细胞敲除Iκκβ经氧化偶氮甲烷(azoxymethane,AOM)/葡聚糖硫酸钠(Dextran Sulfate Sodium,DSS)处理后导致肠道肿瘤发生的体积变小。这些结果说明髓系细胞通过不同的信号途径促进或抑制结肠炎和结直肠癌的发生。接头蛋白Myd88分子也具有保护肠道免疫稳定、调节结肠炎及结直肠癌发生发展的作用。全身敲除Myd88的实验证实Myd88可以促进结直肠癌的发生。多次单纯注射AOM后,肠道散发性肿瘤在ApcMin/+Myd88-/-小鼠的发生率明显低于对照组小鼠;在多次注射致癌剂AOM处理的IL10-/-Myd88-/-小鼠中,Myd88信号途径也起着促进结肠肿瘤发生的作用。但是在炎症状态下,在AOM/DSS致癌模型的小鼠中,Myd88信号可以促进小鼠肠上皮细胞增殖,抑制凋亡,提高DNA修复能力,使小鼠不易患结直肠癌。考虑到这些结果均建立在全身敲除Myd88的基础上,髓系细胞的Myd88分子在大肠肿瘤中发挥的作用仍不清楚。多个文献证实MyD88在不同种类细胞上、不同外界环境影响下对机体肠道内环境发挥着不同的作用。对于非免疫细胞,上皮细胞特异性MyD88缺失导致小鼠发生与年龄相关的自发性小肠炎症。MyD88信号在免疫细胞里的情形较为复杂。T细胞特异性MyD88缺失使小鼠不易患CD4+T细胞引起的结肠炎,而Myd88在B细胞的选择性缺失却可以促进DSS处理后共生菌的侵入感染并促进结直肠癌发生。髓系细胞缺失Myd88的小鼠在DSS处理后结肠炎加重。髓系细胞的Myd88分子在DSS损伤导致的结肠炎症中通过促进大肠肠上皮细胞的增殖而发挥保护肠道作用。但是髓系细胞Myd88信号缺失在AOM/DSS诱发的结直肠癌中所起作用仍然不清楚。为了深入了解髓系细胞Myd88信号缺失对于结直肠癌的影响,我们使用髓系细胞缺失Myd88的小鼠,经AOM/DSS处理,构建了结直肠癌模型,明确髓系细胞Myd88信号在结直肠癌发生发展中的作用,我们这一研究将拓宽髓系细胞Myd88信号的功能和研究视野。方法:小鼠:髓系细胞选择性缺失Myd88小鼠(LysmCre MyD88FL/FL小鼠,Knockout mouse)及其对照小鼠(Wild type mouse)。CAC模型构建:用AOM/DSS方法在LysmCre MyD88FL/FL小鼠及其对照小鼠上构建CAC模型(AOM注射然后饲喂三轮DSS),肉眼及镜下观察小鼠大肠肠道内肿瘤发生、肿瘤负荷、肿瘤病理情况。HE染色:观察LysmCre MyD88FL/FL小鼠及其对照小鼠CAC早期肠道炎症和晚期肿瘤情况。RT-PCR法检测肠道促炎因子、丝裂原因子、促血管形成因子、促肿瘤形成因子等多种细胞因子,检测两种小鼠体重、便血、腹泻、DAI值。流式细胞仪分析:分析LysmCre MyD88FL/FL小鼠及其对照小鼠大肠固有层(laminapropria,LP)、肠系膜淋巴结(mesenteric lymph node,MLN)的 CD45+细胞、中性粒细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞、巨噬细胞、树突状细胞、CD8+T细胞、CD4+T细胞、Treg;分析大肠、骨髓、血液不同部位中的中性粒细胞;分析骨髓中造血干细胞及祖细胞。并分选出大肠固有层的中性粒细胞,检测中性粒细胞分泌的细胞因子变化。流式细胞仪检测LysmCre MyD88FL/FL及WT小鼠大肠Treg水平;分选CD8+T细胞检测分泌细胞因子的变化。Ki67染色显示LysmCre MyD88FL/FL小鼠及其对照组小鼠大肠肠上皮增殖情况;Tunnel染色用于检测小鼠大肠肠上皮细胞的凋亡情况。免疫组化和western blot检测:AOM/DSS处理后,LysmCre MyD88FL/FL小鼠及其对照组小鼠大肠粘膜上皮细胞COX-2,p-STAT3,β-catenin,cyclind1等蛋白表达情况。RT-PCR法检测:LysmCreMyD88FL/FL小鼠及其对照小鼠大肠DNA修复基因Parp1,mlh1,ATM和ATR的表达。β-catenin基因外显子3基因测序是否有突变。结果:LysmCre MyD88FL/FL小鼠经AOM/DSS处理后大肠肿瘤数目比对照组小鼠增多。组织切片分析表明,两种小鼠大肠上均有不典型增生及腺瘤发生,但是LysmCreMyD88FL/FL小鼠腺癌发生率更高。LysmCreMyD88FL/FL小鼠肿瘤数目增多、直径增大导致了肿瘤负荷(肿瘤数目乘以肿瘤平均直径)的明显增加。经AOM/DSS处理后LysmCreMyD88FL/FL小鼠大肠明显短于对照组小鼠大肠。AOM/DSS处理后第13天,LysmCreMyD88FL/FL小鼠大肠有更多的中性粒细胞等炎症细胞聚集,更严重的肠粘膜上皮细胞的损伤,结肠直肠壁水肿,肠绒毛变薄,以及隐窝组织的损伤。AOM/DSS处理后与对照组相比,LysmCreMyD88FL/FL小鼠体重下降更多,腹泻指数及便血评分更高,因此计算出的DAI值(疾病活动指数)在LysmCreMyD88FL/FL小鼠也高于对照组小鼠。大肠标本的qRT-PCR结果表明,AOM/DSS处理后,与对照组小鼠相比,LysmCreMyD88FL/FL小鼠大肠表达的促炎因子(如 IL-6,IL-1β,CCL2,TNFα),丝裂原因子(如IL-6,IL-11),抗菌肽(如Relm-β),促血管形成因子及促组织重塑因子(如MMP10,HIF-1α)均显著升高。与qRT-PCR检测的大肠促炎细胞因子IL-6表达趋势一致,Elisa方法测得LysmCreMyD88FL/FL小鼠血清IL-6表达水平也显著高于WT组;血清IL-17A表达水平也显著高于WT组。为了研究结直肠癌中各种免疫细胞浸润情况,我们制备了 AOM/DSS处理后LysmCreMyD88FL/FL小鼠及其对照组小鼠的大肠固有层单细胞悬液,并且用流式细胞仪分析了大肠固有层CD45+细胞、中性粒细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞、巨噬细胞、树突状细胞、CD8+T细胞和CD4+T细胞。流式结果显示正常情况下未经处理的LysmCreMyD88FL/FL小鼠及其对照组小鼠体内同种细胞比例并无差异。在AOM/DSS处理13天及80天后,大肠CD45+CD11b+细胞在LysmCreMyD88FL/FL小鼠的比例明显高于对照组。与此同时,大肠中性粒细胞在LysmCreMyD88FL/FL小鼠的数量及比例也高于对照组。Gr1+CD11b+的髓系细胞(即中性粒细胞)在LysmCreMyD88+/+小鼠中大约占CD 1 1b+细胞的10%,但是在LysmCreMyD88FL/FL小鼠,这个比例高达15%左右(AOM/DSS处理80天为30%左右),说明在第一轮DSS处理后及第三轮DSS处理后,LysmCreMyD88FL/FL小鼠Gr1+CD11b+髓系细胞显著增加,也就是中性粒细胞明显增多,但是单核细胞与巨噬细胞在AOM/DSS处理后的LysmCreMyD88FL/FL小鼠及其对照小鼠体内无差异,与免疫荧光分析结果一致。即使是第三轮DSS处理后,LysmCreMyD88FL/FL小鼠大肠固有层的中性粒细胞也明显增多,与该小鼠增高的肿瘤负荷有密切关系。LysmCreMyD88FL/FL小鼠大肠增多的中性粒细胞可能来自于骨髓中造血干细胞(Lin-Sca1+c-kit+cells,LSK),AOM/DSS 处理后 LysmCreMyD88FL/FL 小鼠骨髓中 Lin-群体中LSK及髓系祖细胞(Myeloid progenitors,MP)比例明显高于对照组小鼠。三轮DSS后,研究发现LysmCreMyD88FL/FL小鼠大肠固有层中CD11b+Gr1highLy6C+细胞即中性粒细胞仍然高于对照组小鼠,在骨髓中却呈现出相反的趋势,LysmCreMyD88FL/FL小鼠骨髓中中性粒细胞比例低于对照组小鼠,LysmCreMyD88FL/F小鼠血液中性粒细胞比例高于对照组小鼠。流式细胞仪分选出AOM/DSS处理80天后LysmCreMyD88FL/FL小鼠及其对照小鼠Gr1+CD11b+的髓系细胞即中性粒细胞,用qRT-PCR法测得LysmCreMyD88FL/FL小鼠大肠中性粒细胞分泌的IL-1β水平明显高于对照组小鼠大肠中中性粒细胞分泌的IL-1β水平。增加的中性粒细胞及其高表达的IL-1β为LysmCreMyD88FL/FL小鼠提供了一个易于发生肿瘤的肠道炎症微环境。流式细胞仪分选AOM/DSS处理后80天LysmCreMyD88FL/FL小鼠及对照组小鼠大肠固有层CD8+T细胞,结果显示两种小鼠大肠CD8+T细胞比例无异常,RT-PCR检测LysmCreMyD88FL/FL小鼠CD8+T细胞表达细胞因子IFN-γ减少。经AOM/DSS处理后80天,与对照组相比,LysmCre MyD88FL/FL小鼠大肠固有层有更高的Treg水平。AOM/DSS处理后80天,免疫荧光染色法检测LysmCreMyD88FL/FL小鼠及其对照小鼠大肠 CD25+IL-17A+T 细胞,发现 LysmCreMyD88FL/FL 小鼠大肠 CD25+IL-17A+T细胞与对照组小鼠相比数目明显增多。RT-PCR检测AOM/DSS处理后80天LysmCreMyD88FL/FL小鼠及其对照小鼠大肠表达细胞因子IL-2及IL-10无明显差异。用AOM注射及第一轮DSS处理后第三天,LysmCreMyD88FL/FL小鼠大肠肠上皮细胞增殖(用Ki67染色显示)比对照组小鼠明显减弱,AOM/DSS处理后LysmCreMyD88FL/FL小鼠大肠肠上皮细胞的凋亡(用Tunnel染色显示)多于对照组小鼠。镜下见大多数Ki67+细胞位于大肠隐窝,而Tunnel染色阳性细胞多位于肠道腺体顶端。AOM/DSS处理后,通过Western blot分析,LysmCreMyD88FL/FL小鼠大肠粘膜表达COX-2,p-STAT3,β-catenin和cyclinD1水平高于对照组。而免疫组化染色也表明LysmCreMyD88FL/FL小鼠大肠粘膜表达COX-2、p-STAT3和cyclinD1水平高于对照组。RT-PCR结果显示,AOM/DSS处理后早期,LysmCreMyD88FL/FL小鼠大肠表达Parp1,mlh1,ATM和ATR等DNA修复基因低于对照组小鼠。DNA错配基因下调导致LysmCreMyD88FL/FL小鼠AOM/DSS处理后大肠上皮细胞基因不稳定,基因不稳定联合大肠促炎因子表达增高协同促进大肠上皮细胞癌变。DNA测序显示AOM/DSS处理后LysmCreMyD88FL/FL小鼠肿瘤中有β-catenin突变。未处理的LysmCreMyD88FL/FL小鼠(n=3),对照组小鼠(n=5)均无突变。AOM/DSS处理后 LysmCreMyD88FL/FL 小鼠 β-catenin 突变率为 44%(4 of 9),AOM/DSS 处理后对照组小鼠未发现有β-catenin突变(0 of 8 mice)。而且,AOM/DSS处理后LysmCreMyD88FL/FL小鼠β-catenin突变大多位于编码功能性磷酸化氨基酸残基或泛素化位点部位,因此这些突变都可以影响β-catenin降解,激活Wnt途径。β-catenin免疫组化染色显示AOM/DSS处理后的LysmCreMyD88FL/FL小鼠因为基因突变导致β-catenin降解受阻,大肠腺上皮细胞的细胞浆和细胞核中堆积了大量的β-catenin。结论:1.MyD88分子在髓系细胞选择性缺陷,导致小鼠在AOM/DSS致癌模型中肠道肿瘤发生率明显升高,小鼠大肠炎症更重。2.MyD88分子在髓系细胞选择性缺陷,导致小鼠肠道在AOM/DSS致癌模型中能够分泌促炎细胞因子IL-1β的中性粒细胞在肠道组织的浸润增加,小鼠大肠固有层Treg水平增高,CD8+T细胞分泌IFN-y的能力显著下降。3.AOM/DSS致癌模型中MyD88分子在髓系细胞选择性缺陷,小鼠肠上皮细胞增殖下降,凋亡增多,大肠肠上皮细胞损伤后修复能力减弱,导致肠道炎症持久存在;同时小鼠大肠粘膜上皮细胞DNA损伤增加,细胞内基因修复相关基因表达降低,导致结直肠癌发生起重要作用的β-catenin基因突变率升高,最终促进肿瘤形成。意义:首次用实验证实了:髓系细胞Myd88分子通过抑制肿瘤微环境的形成、促进基因修复、稳固肠上皮细胞基因等机制可以抑制结直肠癌的发生。