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[目的] 鼻咽癌的复发和转移是晚期患者致死的主要原因,传统的治疗方法并没有很好地解决这两个问题,以至于鼻咽癌的晚期治疗遇到很大的瓶颈。近年研究发现很多天然化合物对癌症的治疗有很好效果,而且毒性低,副作用少。本研究旨在研究3-甲氧基槲皮素对鼻咽癌细胞增殖周期、凋亡和转移的影响,及其机制的初步研究。 [方法] 1.CCK-8法检测3-甲氧基槲皮素对鼻咽癌细胞的增殖的影响; 2.流式细胞仪检测3-甲氧基槲皮素对鼻咽癌细胞的周期的阻滞效果; 3.Western blot检测周期调控蛋白的表达情况。 4.流式细胞仪检测3-甲氧基槲皮素对鼻咽癌细胞的凋亡的影响; 5.Western blot检测药物处理后凋亡相关蛋白的表达情况以及与凋亡相关的信号通路。 6.划痕实验和Transwell实验检测3-甲氧基槲皮素对鼻咽癌细胞转移的影响; 7.Western blot检测3-甲氧基槲皮素对上皮间质转化的影响; 8.Western blot检测3-甲氧基槲皮素对鼻咽癌干性基因的表达情况。 [结果] 3-甲氧基槲皮素可以抑制鼻咽癌细胞CNE-1、CNE-2和HNE-1的增殖。药物作用48h后,在高浓度(40μmol/L)作用下,三种癌细胞生长停滞;在低浓度(低于20μmol/L)时,三种癌细胞均受到明显抑制,而对正常人永生化鼻咽上皮细胞NP69的增殖基本不影响。由于细胞增殖受到明显抑制,我们检测细胞周期,发现与对照组相比,药物处理组24h后,CNE-2细胞的G2/M期比例增加,48h后CNE-2和HNE-1的G2/M期比例均明显增加,且随着药物浓度增加而增加,差异有统计学意(P<0.05)。进一步分析发现3-甲氧基槲皮素下调G2期的主要作用蛋白cyclinB1的表达,且随着药物浓度增加显著降低,随着作用时间的延长也显著减低,差异有统计学意(P<0.05)。 3-甲氧基槲皮素可以诱导鼻咽癌细胞CNE-2和HNE-1的凋亡。不同浓度的3-甲氧基槲皮素处理CNE-2和HNE-1两种鼻咽癌细胞,发现在药物作用24h后,与对照组相比,药物组的凋亡比例并没有明显增加,48h后早期凋亡和晚期凋亡的细胞数目均增加,差异有统计学意(P<0.05)。通过Western Blot检测凋亡相关蛋白发现,凋亡效应蛋白caspase-3在药物作用18h后活化增加,在对应时间点上,促凋亡蛋白Bim的活化也增加,定位在线粒体膜上的抗凋亡蛋白Mcl-1的表达显著下调,在Mcl-1下调之前,直接调节Mcl-1表达的pSTAT3已显著下降,STAT3本身的表达量并没有下调,且上述蛋白都随着药物作用浓度的增加而发生相应的变化,差异有统计学意(P<0.05)。 3-甲氧基槲皮素可以抑制鼻咽癌细胞CNE-2和HNE-1的转移。划痕实验证明3-甲氧基槲皮素可以抑制鼻咽癌细胞迁移,对照组中CNE2细胞在药物24h已进入划痕区,48h已完全愈合,而实验组CNE2细胞低浓度下迁移缓慢,高浓度(20μmol/L)处理后迁移停滞;迁移速度更快的HNE-1细胞,对照组12h几乎愈合,而低浓度药物组只有部分细胞进入划痕区域,同样明显的是,24h后高浓度药物组仍然没有细胞移动,迁移被完全抑制。Transwell实验证明3-甲氧基槲皮素可以抑制鼻咽癌细胞浸润,CNE-2和HNE-1均得到相似的结果,3-甲氧基槲皮素24h后,对照组有大量细胞浸入下室,药物处理组明显减少,尤其是20μmol/L处理后,下室只见个别细胞。因上皮间质转化与转移和细胞干性密切相关,我们发现3-甲氧基槲皮素可升高上皮间质转化的重要标志物E-钙黏蛋白的表达,随作用时间的推移和药物浓度的增加均表达上调,同时下调很多于性基因(SOX2和Nanog)的表达,差异有统计学意义(P<0.05),证明3-甲氧基槲皮素可抑制上皮间质转化。 [结论] 1.3-甲氧基槲皮素通过下调cyclinB1的表达,将鼻咽癌细胞阻滞在G2/M期,而抑制鼻咽癌细胞的增殖,而对正常人永生化鼻咽上皮细胞的增殖基本不影响。 2.3-甲氧基槲皮素可以抑制STAT3的磷酸化,从而下调抗凋亡蛋白Mcl-1的表达,导致促凋亡蛋白Bim的活化,然后裂解激活凋亡效应蛋白caspase3,最终通过线粒体凋亡途径促进鼻咽癌细胞的凋亡。 3.3-甲氧基槲皮素通过抑制上皮间质转化阻止鼻咽癌细胞的转移,同时抑制了鼻咽癌细胞的干性。