以ESKAPE（屎肠球菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、肠杆菌）为代表的多药耐药菌所致感染,已成为威胁人类健康的全球公共卫生安全问题,因此研发新型抗菌药物迫在眉睫。抗菌肽（AMPs）是一类具有抗菌活性的多肽,主要通过膜破坏机制发挥抗菌作用,细菌不易对其产生耐药性,有望成为下一代新型抗菌药物。然而,多数AMPs体内稳定性较差,严重限制了其向临床应用转化。订合肽策略通过侧链环化的方式限定螺旋结构肽的二级结构,可显著提高多肽的稳定性及成药性,其中通过烯烃复分解反应形成全烃桥联订合肽的策略应用最为广泛。此前已有多个研究表明应用全烃桥联订合策略可提高多肽类药物的体内稳定性,然而,通过该策略合成的订合抗菌肽由于在两亲性抗菌肽的疏水侧引入疏水性桥联结构,使抗菌肽的溶血毒性也显著增强,因此,限制了该策略的应用。为了解决这一问题,我们课题组在此前研究中提出了一种新型的赖氨酸桥联订合策略,通过赖氨酸侧链ε-氨基的N-烷基化反应,首次在抗菌肽的亲水性一侧引入桥联结构,该策略在保证抗菌肽亲水性一侧结构完整的同时,增强了抗菌肽的二级结构稳定性。利用赖氨酸订合策略对阳离子抗菌肽OH-CM6进行订合位点筛选后,发现一种相比于线性肽具有更强抗菌活性和更高血清稳定的OH-CM6订合肽,同时未表现出溶血毒性的增强,证明了该策略在以AMPs为基础的新型抗菌药物开发中具有重要的应用前景。因此,本论文研究拟对该策略在抗菌肽修饰中的应用进行更深入的研究,围绕探究赖氨酸桥联订合策略的适用范围及订合结构对AMPs生物活性的影响,本论文主要进行了以下研究工作:1.综述了细菌耐药性的现状与发生机制,抗菌肽的理化性质、作用机制、研究现状,多肽类药物的修饰改造方法及订合肽修饰策略;并基于以上背景,提出了本课题的设计思路、研究内容与创新之处。2.选取具有不同长度、电荷数、两亲性的5条AMPs作为模板肽,对其i,i+4位赖氨酸进行订合位点扫描,合成一系列订合抗菌肽。通过对线性肽与订合肽的生物活性研究进行比较分析,发现赖氨酸桥连订合策略对AMPs生物活性的影响与抗菌肽氨基酸序列及订合位点具有密切关系。对于具有较高两亲性结构的抗菌肽,赖氨酸订合策略可以显著提高抗菌肽的抗菌活性与稳定性,而对具有较高疏水性的抗菌肽的生物活性没有明显的改善。3.以两亲性阳离子抗菌肽BF15-a1为模板,选用具有不同疏水性及刚性的烷基化试剂对其i,i+4位赖氨酸进行订合位点扫描,合成一系列BF15-a1订合肽。通过对BF15-a1订合肽的生物活性研究,进一步证实了订合位点选择的重要性。同时,订合结构自身的刚性与疏水性也对订合抗菌肽的抗菌活性与溶血毒性具有显著的影响。4.通过前述两部分的研究,本研究筛选出基于抗菌肽BF15-a1的订合肽LS-BF1相较于线性肽BF15-a1具有显著提高的血浆稳定性,同时对临床分离的多药耐药ESKAPE细菌具有广谱高效的抗菌活性。通过对其抗菌机制进行研究,发现订合肽LS-BF1相较于线性肽具有杀菌速度快、破膜能力强且不易产生耐药性等优点。LS-BF1在小鼠MRSA腹腔感染模型治疗中展现出显著的体内抗菌活性,同时,LS-BF1在高剂量连续给药的条件下也不会产生显著毒性,表现出良好的体内安全性。综上所述,本文将赖氨酸桥联订合策略应用于具有不同理化性质的α-螺旋结构AMPs,探究了该策略的在抗菌肽修饰中的适用范围,并研究了抗菌肽氨基酸序列、订合位点及订合结构对订合抗菌肽生物活性的影响。通过对合成的一系列订合抗菌肽进行生物活性筛选,发现订合肽LS-BF1具有广谱高效抗菌活性、显著增强的稳定性及低溶血毒性。通过小鼠模型证实LS-BF1具有良好的体内抗菌活性及安全性,表明其是一种具有潜在临床应用前景的候选抗菌药物。通过本论文研究,证实了赖氨酸订合策略在基于抗菌肽的新型抗菌药物研究中具有重要的应用价值,有望推动基于抗菌肽的新型抗生素开发。