研究背景和目的:胆囊癌（Gallbladder cancer,GBC）是胆道系统中发病率最高的肿瘤,发病率在消化道恶性肿瘤中排第6位。全世界每年有165000人死于该疾病,大概占全球肿瘤相关死亡人数的1.7%。进入21世纪,随着我国国民经济的不断发展,胆囊癌在我国的发病率呈逐渐升高态势。目前针对胆囊癌最主要的治疗方式为外科切除。但由于该肿瘤恶性程度高,病程进展快,肿瘤很快就侵犯周围组织器官,并经血运或淋巴系统发生远处转移,因此大部分胆囊癌患者就诊时已经到了进展期或者晚期,丧失了根治性手术机会。尽管放化疗可能使胆囊癌病人受益,但并不能从根本上延长患者生存期。针对胆囊癌,研发行之有效的早期筛查和诊断的方法、开发敏感的靶向或免疫药物是未来治疗的关键。因此,需要系统研究胆囊癌发病进程里肿瘤细胞增殖、迁移以及远处转移的分子机制,以期发现敏感性和特异性俱佳的标志物和潜在治疗靶点。FOXK1是FOX转录因子家族成员之一。研究显示其在细胞生长、代谢、周期调控、凋亡、自噬等进程中扮演重要角色。并且最近的研究表明,FOXK1在一些肿瘤组织表达量异常升高,并与患者的预后密切相关,提示其与肿瘤的发生存在一定相关性。然而,其在胆囊癌样本里的表达情况及可能发挥的功能尚不明确。因此,本课题的目的是探讨FOXK1在胆囊癌发生发展中的作用及潜在的分子机制。研究方法:1、提取42对新鲜胆囊癌组织及相应的癌旁粘膜组织的RNA,反转录后得到c DNA。通过实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测FOXK1在m RNA水平上的表达差异。2、随机选取10对胆囊癌组织及配对的癌旁粘膜组织,提取蛋白,采用蛋白免疫印迹的方法检测FOXK1蛋白分子在组织中的表达差异。3、利用免疫组织化学技术评估97例胆囊癌及64例胆囊炎粘膜样本中FOXK1表达情况,并进行比较。根据免疫组化评分,统计分析肿瘤样本中FOXK1表达情况与胆囊癌病人临床病理参数及生存预后的关系。4、构建稳定高表达及低表达FOXK1的胆囊癌细胞株。利用CCK-8与平板克隆形成实验技术评估FOXK1在胆囊癌细胞增殖中的作用。采用流式细胞术评估FOXK1对胆囊癌细胞周期进程及凋亡的作用。蛋白免疫印迹的技术评估FOXK1对调节细胞周期的关键分子表达的影响。5、采用划痕和Transwell实验评估FOXK1对胆囊癌细胞迁移和侵袭的影响。采用免疫印迹的技术手段评估FOXK1对EMT相关分子表型表达量的影响。6、通过裸鼠皮下荷瘤实验检测FOXK1在体内对胆囊癌细胞生长的作用。通过构建裸鼠肺转移模型,检测在裸鼠体内,FOXK1对胆囊癌细胞转移的作用。7、通过在线数据库GEO数据库中FOXK1-CHIP-seq测序数据,进行通路分析,探索FOXK1作用通路。采用蛋白免疫印迹的方法验证预测的作用机制。实验结果:（1）FOXK1在胆囊癌组织里的表达升高,并且与病人预后相关qRT-PCR结果显示在m RNA水平上,FOXK1在42对胆囊癌样本里的表达量明显高于癌旁粘膜（P<0.01）。免疫印迹技术评估10对胆囊癌样本中FOXK1的蛋白水平,其中有8名患者的癌组织里FOXK1蛋白含量显著多于癌旁粘膜组织。免疫组化及评分结果显示FOXK1分子主要存在于细胞核中,在97例胆囊癌组织里,FOXK1呈强阳性、中等强度、弱阳性和阴性的比例分别为23%（22/97）、43%（42/97）、21%（20/97）和13%（13/97）。而在64例胆囊炎粘膜组织中,这一比例分别为6%（4/64）、13%（8/64）、22%（14/64）、59%（38/64）,二者差异有统计学意义。胆囊癌样本中FOXK1的表达水平与肿瘤TNM分期（c2=6.220,P=0.013）、肿瘤的分化程度（c2=4.279,P=0.039）及肝脏侵犯（c2=6.820,P=0.009）显著相关。97例病例的中位生存期为9.5个月,其中FOXK1高表达组为7.5个月,而低表达组为15.3个月。K-M生存分析显示FOXK1高表达的胆囊癌患者与低表达组相比较,其总体生存时间（OS）明显缩短（P=0.007）。（2）FOXK1对胆囊癌细胞生长速率、细胞周期及凋亡的作用免疫印迹检测提示FOXK1在GBC-SD和NOZ细胞株中呈高表达,而在SGC-996为低表达,在EH-GB1里表达程度中等。采用GBC-SD和NOZ细胞株构建稳定低表达FOXK1细胞株,采用SGC-996细胞构建稳定高表达FOXK1细胞株。CCK-8及克隆形成实验结果提示降低FOXK1表达后,GBC-SD和NOZ细胞增殖速率和克隆数目显著下降。相反过表达FOXK1促进SGC-996细胞增殖。流式技术检测细胞周期实验表明,在GBC-SD与NOZ细胞干扰FOXK1表达后,G0/G1期细胞百分比增加,而处在S期和G2/M的细胞百分比减少。免疫印迹检测结果显示,敲减FOXK1后,细胞周期调节关键分子CDK4、CDK6、Cyclin D1、Cyclin E1表达下降。流式实验结果发现干扰FOXK1对凋亡细胞百分比无明显影响。裸鼠荷瘤实验显示敲减FOXK1组小鼠种植瘤生长速率及重量小于对照组,且肿瘤组织中Ki-67表达量也下降。（3）FOXK1对胆囊癌细胞侵袭和转移的作用划痕及Transwell实验提示敲减FOXK1后,GBC-SD和NOZ细胞的迁移和侵袭能力变弱,而FOXK1表达上调可增强SGC-996细胞的运动能力。采用免疫印迹检测FOXK1对EMT相关蛋白表达影响。结果显示敲减FOXK1后,GBC-SD和NOZ细胞上皮分子表型E-cadherin表达上调,而间质分子表型N-cadherin、Vimentin表达下降,过表达FOXK1后,SGC-996细胞的N-cadherin、Vimentin表达上调,而E-cadherin表达下降。裸鼠肺转移模型结果显示,FOXK1敲减组小鼠发生肺转移的概率及转移瘤的大小都明显小于对照组。（4）FOXK1调控胆囊癌生长和转移的细胞机制研究通过对GEO数据库数据集GSE 51673的FOXK1-Ch IP-seq数据进行通路分析,提示FOXK1可能通过激活Akt/mTOR信号通路发挥作用。进一步免疫印迹检测发现敲减FOXK1后,肿瘤细胞p-AKT与p-mTOR的蛋白表达量显著减少,而总AKT与总mTOR的含量无显著改变。与之相反,转染FOXK1质粒后,细胞中p-AKT与p-mTOR的蛋白表达量显著增加。CCK-8和Transwell实验提示AKT抑制剂MK2206可降低FOXK1对胆囊癌细胞增殖、迁移和侵袭的增强作用。实验结论:FOXK1在胆囊癌组织里的表达上调,且FOXK1的表达水平与肿瘤的肝脏侵犯、癌组织分化水平、TNM分期及预后相关,癌组织中FOXK1高表达是预测胆囊癌不良预后的独立危险因素。FOXK1通过调控细胞周期增强胆囊癌细胞生长速率,通过诱导胆囊癌细胞发生EMT,促进肿瘤细胞侵袭和转移的能力。分子通路机制研究表明,FOXK1可能是通过激活Akt/mTOR信号转导通路机制促进胆囊癌的进展。