研究背景及目的肝细胞肝癌(Hepatocellular carcinoma, HCC)是全球高发恶性肿瘤之一，其死亡率在成年人因肿瘤所致死亡中排到第三位，而我国更是肝癌发病的“重灾区”，我国每年新增肝癌患者超过全球新发病例的一半。近年来，随着诊疗技术的不断发展，肝癌的诊治工作取得了很大的进步。尽管手术切除、肝移植以及多种微创治疗手段的广泛应用对肝癌患者的预后改善起到了很大的作用，但是由于较高的复发率和转移率，肝癌患者的预后仍然不容乐观。目前，越来越多的研究认为具有多种干细胞特性的肿瘤干细胞(Cancer stem cell,CSC)可以通过促进肿瘤的侵袭转移从而影响其预后。肿瘤干细胞或者称之为肿瘤起始细胞，被定义为一群具有自我更新、多向分化和增殖潜能的肿瘤细胞。随着对肿瘤干细胞研究的不断深入，人们发现肿瘤干细胞稳态的维持有赖于特定的肿瘤微环境，但是，肝癌中肿瘤微环境究竟是如何调控肿瘤细胞干细胞特性的目前尚未弄清。巨噬细胞是肿瘤组织中广泛存在的一类炎症细胞，在肿瘤微环境中占据了重要位置。活化的巨噬细胞主要有两种表型，一类是经典激活的巨噬细胞，即M1型巨噬细胞，主要发挥抗炎、抗肿瘤免疫；另一类是选择性激活的巨噬细胞，即M2型巨噬细胞，具有促进肿瘤发生发展的作用。肿瘤微环境中浸润的巨噬细胞被定义为肿瘤相关巨噬细胞(Tumor-associated macrophage, TAM)，因其具有类似于M2型巨噬细胞的细胞表型及功能特征，被认为是M2型巨噬细胞。相关研究表明，TAM的密度增高往往提示肿瘤的不良预后。不少研究证实，TAM可以促进肿瘤细胞获得干细胞特性、发生上皮间质转化。然而，TAM在肝癌细胞干细胞特性维持中发挥的作用及其调节机制仍然有待研究。上皮间质转化(Epithelial to mesenchymal transition, EMT)是上皮来源的肿瘤细胞失去上皮细胞特性同时获得间质细胞表型的过程，该过程被认为是肿瘤细胞获得侵袭转移能力的关键步骤。有研究揭示肿瘤细胞利用EMT作为一个中介从而获得自我更新以及适应微环境的能力，通过EMT过程获得间质细胞特性来促进肿瘤的侵袭转移。转化生长因子-β1(Transforming growth factor, TGF-β1)是转化生长因子家族中最重要的成员之一，它是EMT最强的诱变剂之一。越来越多的研究指出，TGF-β1在肿瘤进展和转移中具有相当的重要性。也有报道证实，肿瘤微环境中释放的TGF-β1对于多种上皮肿瘤如皮肤癌、胃肠道肿瘤、膀胱癌和肝癌肿瘤细胞的干细胞特性的维持发挥作用。在本研究中，我们重点分析了TGF-β1在TAM对肝癌细胞的干细胞特性的调节中发挥的作用。我们采用TAM条件培养基处理小鼠的肝癌细胞系Hepa1-6，从以下三个方面探讨：（1）肝癌TAM诱导的EMT对于肿瘤细胞干细胞特征的影响观察；（2）肝癌TAM诱导肿瘤细胞发生EMT的分子机制探讨；（3）TAM及CSC判断肝癌临床预后的作用评估。研究方法及结果第一部分肝癌TAM诱导的EMT对于肿瘤细胞干细胞特性的影响观察在研究的第一部分，我们首先采用免疫荧光染色检测分析人肝癌组织标本中TAM及CSC的表达及其位置关系，结果显示在肿瘤边缘区域EpCAM+CSC的分布和CD68+TAM的分布密切相关。然后我们采用IL-4处理小鼠巨噬细胞系RAW264.7制备TAM的条件培养基，为研究TAM对于肝癌细胞干性调节的作用，我们利用该条件培养基共培养小鼠肝癌细胞系Hepa1-6，克隆形成实验检测处理组和对照组Hepa1-6细胞的集落形成能力，RT-PCR检测干细胞相关转录因子Klf-4、Bmi-1的基因表达，我们发现经TAM-CM处理过的细胞有更强的干性。同时使用细胞荧光染色、RT-PCR以及Western blot从细胞水平、蛋白水平和基因水平检测处理组和对照组细胞中上皮细胞标志物E-cadherin、间质细胞标志物N-cadherin、Vimentin和EMT相关转录因子Snail的表达变化，这些实验均提示TAM促进肿瘤细胞的EMT发生。此外Transwell、划痕愈合实验被用来检测TAM对于肝癌细胞Hepa1-6侵袭转移能力的影响，实验结果表明TAM可以促进肿瘤细胞的侵袭转移。最后，对照体外实验结果，我们利用C57小鼠皮下成瘤实验比较两组细胞的皮下成瘤能力，我们发现，TAM处理过的Hepa1-6细胞有更强的成瘤能力。第一部分的实验结果表明，TAM可以通过诱导EMT促进肝癌细胞的干细胞特性。第二部分肝癌TAM诱导肿瘤细胞发生EMT的分子机制探讨第二部分主要探讨TAM诱导肿瘤细胞发生EMT的分子机制。首先，我们对人肝癌组织标本切片进行免疫荧光染色，检测其中巨噬细胞及TGF-β1的表达，实验结果证实肿瘤组织中TGF-β1高表达的区域巨噬细胞的密度也比较高。随后，分别用LPS+IFN-γ以及IL-4分别刺激小鼠巨噬细胞RAW264.7，并用RT-PCR、ELISA分别从基因水平及蛋白分泌水平检测未经刺激和两组不同刺激的巨噬细胞中TGF-β1的表达，实验结果显示，IL-4刺激激活的M2型巨噬细胞中的TGF-β1远高于未经刺激的巨噬细胞及LPS+IFN-γ刺激形成的M1型巨噬细胞中TGF-β1的表达。为了研究TGF-β1在TAM对肝癌细胞调控中的作用，我们采用TGF-β1中和抗体中和TAM-CM中的TGF-β1，分别用TGF-β1中和抗体处理过的TAM-CM和未经处理的TAM-CM培养Hepa1-6细胞。然后用RT-PCR检测这两组细胞干细胞相关转录因子Klf-4、Bmi-1的基因表达，克隆形成实验检测两组细胞的集落形成能力，并用RT-PCR以及Westernblot对比这两组细胞中EMT标志物如上皮细胞标志物E-cadherin、间质细胞标志物N-cadherin、Vimentin和转录因子Snail的表达变化，以及Transwell实验和划痕愈合实验检测这两组细胞的侵袭转移能力差异，实验结果显示，免疫清除了TAM-CM中的TGF-β1可以抑制肿瘤细胞EMT、侵袭转移的能力，肿瘤细胞的干细胞特性明显减弱。第三部分TAM及CSC判断肝癌临床预后的作用评估结合前两部分实验结果，利用免疫组化染色检测90例肝癌患者的组织标本中干细胞标志物EpCAM和巨噬细胞标志物CD68，利用IPP软件进行图像分析EpCAM和CD68的表达水平，并结合随访资料，对生存资料进行Kaplan-Meier分析。结果显示EpCAM表达阳性的患者预后远差于EpCAM表达阴性的患者，而EpCAM表达阳性的患者中，CD68表达阳性的患者的预后要差于CD68表达阴性的患者。因此，将干细胞标志物和巨噬细胞标志物结合分析可以更好的对肝癌患者预后进行预测。[结论]综上所述，结合三部分研究结果，可以得出以下结论：1. TAM可以通过EMT促进肝癌细胞的干细胞特性；2. TAM经由TGF-β1通路诱导EMT的发生，从而促进肝癌细胞的干细胞特性；3.将CSC和TAM结合分析可以更好的对肝癌患者预后进行预测，EpCAM表达阳性的患者中，CD68低表达的患者的预后要好于CD68高表达的患者。