论文部分内容阅读
光学活性亚砜是一类重要的手性中间体,也是一些含硫药物结构的重要组成部分,例如用于治疗胃食管反流性疾病的质子泵抑制剂,也称为拉唑类药物。光学活性亚砜一般通过对其前体硫醚的不对称单加氧反应获得,除了化学氧化法之外,近年来生物催化的硫醚不对称单加氧反应的发展也很迅速。能催化硫醚不对称单加氧反应的生物催化剂主要有两大类,包括 Baeyer-Villiger 单加氧酶(Baeyer-Villiger monooxygenases,BVMOs)和细胞色素 P450 单加氧酶(Cytochrome P450 monooxygenases,CYPs)。本论文对这两类单加氧酶催化的硫醚不对称单加氧反应进行了系统研究,主要包括三部分内容:1)新型BVMOs的发现和纯化表征;2)醋酸钙不动杆菌环己酮单加氧酶(AcCHMO)的分子改造和结构功能关系分析;3)细胞色素型硫醚单加氧酶P450SMO催化过程的电子传递机理分析。第一部分:BVMOs作为一种能催化硫醚不对称氧化反应的生物催化剂,近年来受到了众多研究者的青睐。虽然BVMOs的底物谱很宽,但是目前尚未报道能够催化拉唑硫醚氧化的天然酶。因此我们选择能够催化大位阻硫醚底物的EtaA和能够催化苯甲硫醚(Methy1 phenyl sulfide,MPS)的CHMONCIMB9871为模板,进行了基因组数据库挖掘并测定了候选酶对MPS和奥美拉唑硫醚(Omeprazole sulfide,OPS)的催化能力。其中来源于Bradyrhizobium oligotrophicum和Aeromicrobium marinum的BoBVMO和AmBVMO对OPS具有相对较高的催化活性,而来源于Acinetobacter calcoaceticus的AcCHMO对MPS具有较高的催化活性。因此,我们选择这三个重组酶为研究对象,对其进行了纯化和催化性能研究。进化树及序列分析表明,这三个酶属于典型的I类BVMOs。底物谱考察表明,它们对MPS的催化活力最高,分别达到117、25和839U/gprotein。BoBVMO和AmBVMO对OPS的催化活力分别为18和24U/gprotein,但是这两个酶在大肠杆菌中基本上为包涵体表达且热稳定性较差。而AcCHMO虽然不能催化大位阻硫醚底物的不对称氧化反应,但是其可溶性和稳定性要优于BoBVMO和AmBVMO,在30℃的半衰期达到20 h,是BoBVMO和AmBVMO的4.5和3.7倍。第二部分:我们选择AcCHMO作为进一步研究对象,对其底物特异性进行了改造。通过对底物通道瓶颈周围氨基酸的活性位点组合饱和突变,成功获得了突变体AcCHMOM1(K326C/F432L),实现了对OPS氧化活性从无到有的突破。在此突变体的基础上,对酶的底物口袋、底物通道、FAD和NADPH结合位点等核心区域进行了迭代饱和突变库的构建,以及对全长蛋白进行了易错PCR突变库的构建。利用底物硫醚和产物亚砜溶解度的差异,创新设计了一种基于平板透明圈的高通量筛选方法,对AcCHMOM1催化OPS的活性进行了定向进化,使其活力提高至30.3 U/gprotein。纯酶的反应结果表明,最优突变体AcCHMOM6在22 h内催化3 g L-1 OPS生成(S)-奥美拉唑的转化率达到96%。同时,AcCHMO及其突变体对4种结构从小到大底物(环己酮,MPS,5-甲氧基-2-甲基硫-1H-苯并咪唑和OPS)的活力变化规律,揭示了其底物特异性的转变历程。另外,我们对AcCHMO及其突变体进行了结构解析,成功得到了突变体AcCHMOM2的晶体结构,并初步阐释了其底物特异性改变的结构基础:底物通道的形状和大小是决定其底物特异性的关键。第三部分:本实验室前期从红球菌(Rhodococcus sp.)ECU0066中克隆得到一个硫醚单加氧酶P450SMO,它对一系列小分子硫醚底物具有良好的催化活力及立体选择性。P450SMO虽然也能催化OpS的不对称氧化,但其催化效率极低(<10-4U/gprotein)。P450SMO属于细胞色素CYPs的Class Ⅳ家族,该家族的CYPs具有“自给自足”的电子传递系统,但是电子传递效率低下仍是其应用的主要限制性因素,因此揭示其电子传递的机制对于进一步改善酶的催化性能至关重要。前期在本实验室和上海有机所周佳海组的共同努力下,已经成功解析了 P450sMO的晶体结构。在此基础上,本论文对其电子传递过程中蛋白的构象动态变化进行了系统研究。我们通过对参与催化过程的蛋白各结构域进行波谱学分析,分别测定了电子传递过程各步骤的动力学。结果显示,Fe2S2结构域将电子从FMN传递给heme这一过程是限速步骤。结合晶体结构的分析,我们推测Fe2S2结构域在电子传递过程中可能发生较大的构象变化,以便实现电子的顺利转移。利用蛋白质交联质谱和单分子荧光共振能量转移技术,对上述假设进行了验证,发现P450SMO的Fe2S2结构域存在着两种典型构象,一种是靠近FMN的“F-构象”,另一种是靠近heme的“H-构象”,这两种构象的动态变化受到不同还原剂如DTT、NADPH或Na2S2O3的调控。最终,我们提出了 P450SMO催化循环中由构象变化控制的两步电子传递机制:第一步,当FMN获得NADPH的电子后传递给氧化态的Fe2S2中心,这时Fe2S2中心处于“F-构象”;第二步,当Fe2S2中心得到电子后将发生构象变化,使其转变为“H-构象”,从而将电子顺利转移给heme,开始催化循环。