论文部分内容阅读
背景介绍:腰椎管狭窄产生的神经症状严重影响着患者生活质量,且多发生于老年患者,近年来,随着糖尿病、高血压、心脏病等慢性疾病发病率的增高,使得通过切除黄韧带达到椎管减压的手术并发症增多,使得大量症状严重、影像学表现典型的患者因为基础疾病或身体状态不能耐手术手而长期遭受疾病的折磨。因此如何预防或降低黄韧带肥厚程度是腰椎管狭窄症保守治疗的基础及临床病理机制研究中的难点和重点。退变性黄韧带中TGF-β1及炎症因子COX-2、TNF-a、IL-1、8、15的高表达已得到证实:韧带纤维化或瘢痕修复可能是黄韧带增生肥厚的病理学机制之一。TGF-β1及其下游的Smad信号传导通路在纤维化疾病、瘢痕组织纤维性修复的病理过程中具有重要意义。NF-kB是炎症蛋白表达的重要调控因子,且TGF-β1对NF-kB依赖性炎性反应的调控作用已在其它纤维化疾病中得到证实。目前,国内、外关于TGF-Bl与NF-kB之间的相互作用在腰椎黄韧带肥厚中的研究相对较少。因此本研究旨在探讨TGF-β1通路与NF-kB在黄韧带增生病理网络中的相互作用,为今后黄韧带增生抑制药物的研制提供依据。目的:检测肥厚黄韧带中NF-kB的表达情况,在腰椎黄韧带细胞中加入外源性TGF-β1细胞因子观察是否可以促进腰椎黄韧带细胞的炎症反应,进一步通过添加NF-kB抑制剂PDTC,通过检测相关炎症介质表达的变化,从而探讨TGF-β1通路与NF-kB在黄韧带增生病理网络中的相互作用。方法:取2015年3月至2015年7月69例因腰椎管狭窄症(LSS)以及在影像学上没有黄韧带肥厚表现的腰椎间盘突出症(LDH)于我院行腰椎手术患者的黄韧带标本。其中包括49例LSS患者,男27例,女22例,平均年龄58±3.5岁:20例LDH患者,男12例,女8例,平均年龄51±5.5岁。其中21例LSS患者及20例LDH患者的黄韧带标本用于组织化学及免疫组化实验,剩余28例LSS患者的标本采用胶原酶预消化组织块培养法进行黄韧带细胞(LFC)原代培养,将处于指数生长期(P5)的细胞以8×10个/L密度接种于96孔板,将0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 ng/L人重组TGF-β1分别加入培养基中培养24、48小时,通过MTT比色法选出最佳药物浓度进行下一步实验,常规培养基培养的细胞为空白对照组。采用WESTERN、Elisa及实时荧光定量PCR(RT—CR)法检测LFC中NF-kB及炎性介质IL-1 β 、 IL-8、 IL-15表达。然后将细胞分为A、B、C三组:A组:按照测得的最佳药物浓度单纯添加TGF-β1细胞因子进行培养;B组:加入NF-kB抑制剂毗咯烷二硫代氨基甲酸盐(PDTC),接着添加重组人TGF-β1细胞因子;C组:单纯添加PBS作为空白对照组。细胞培养48小时,采用RT-PCR技术检测各组细胞中NF-kB、 IL-1β、 8、 15的基因表达水平。结果:MRI图像上,LSS组患者的黄韧带厚度明显大于LDH组的(p<0.05),年龄与黄韧带厚度无明显相关性(p>0.05)。与没有肥厚的LDH组相反,LSS组中观察到弹性纤维的退变,包括不均匀,零散的,排列紊乱的纤维,呈波浪状,伴有胶原纤维的增生,并可见钙化。纤维化评分和黄韧带的厚度存在显著线性相关(p<0.05)。最严重的纤维化改变是在背侧黄韧带。免疫组化分析显示LSS组NF-kB p65阳性率明显高于LDH组(p<0.05),并且与黄韧带纤维化评分呈正相关关系。Western-Blot及Elisa结果证实,加入TGF-β1后,NF-kB及IL-1p、8、15的表达量均较对照组出现了升高。TGF-β1+PDTC与TGF-β1组相比,IL-1β基因表达水平降低,但没有统计学意义(p>0.05), TGF-β1+PDTC组与TGF-β1组相比,IL-8、15基因表达水平均显著性降低(p<0.05)。结论:1、肥厚的黄韧带出现明显的退行性表现2、腰椎管狭窄患者黄韧带NF-κB含量增高,与纤维化程度成正比。3、黄韧带细胞中,TGF-β1促进NF-κB的表达。4、NF-κB通过调控炎症因子的基因表达而在黄韧带肥厚的病理过程中有着重要作用。