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第一部分miR-21对心肌成纤维细胞的调控作用和机制研究【目的】心肌成纤维细胞(cardiac fibroblasts,CFs)是心肌纤维化(myocardial fibrosis,MF)的效应细胞。CFs的功能状态在MF的病理进程中有核心作用。研究发现miR-21参与纤维化疾病的调控。此部分研究将对miR-21调控CFs功能和状态的作用和机制进行探讨。【方法】分离培养原代小鼠心肌成纤维细胞,构建促细胞纤维化模型(TGF-β1),转染miR-21类似物(miR-21 mimic)、miR-21抑制物(miR-21 inhibiter),抑制或过表达细胞miR-21。随机分为正常对照组、TGF-β1组、miR-21-mimic组、TGF-β1+miR-21inhibiter组。real-time PCR方法检测miR-21的表达,免疫印迹法法检测α-SMA、p ERK/ERK的表达,MTT法检测细胞增殖水平,El ASA法检测Ⅰ型胶原,Ⅲ型胶原的表达。【结果】与正常对照组比较,TGF-β1组CFs的增殖能力明显增加,差异有统计学意义(P<0.05),TGF-β1组较正常对照组CFs胶原合成和α-SMA的表达明显增加,差异有统计学意义(P<0.05);TGF-β1能够上调CFs的miR-21的水平;与正常对照组进行比较,miR-21 mimic组CFs的增殖能力明显增加(P<0.05),CFs胶原合成和α-SMA表达增加,TGF-β1+miR-21-inhibiter组较TGF-β1组,胶原表达降低(P<0.05),α-SMA的表达水平也有所降低(P<0.05);miR-21 mimic组较正常对照组细胞p ERK/ERK的水平增加,差异具有显著性(P<0.05),而TGF-β1+miR-21-inhibiter组较TGF-β1组,p ERK/ERK表达显著降低(P<0.05)【结论】本部分研究表明miR-21可能是TGF-β1的下游调节因子,对CFs具有促纤维化效应,促进CFs增殖与活化,增加胶原合成和α-SMA的表达;miR-21可能通过调控p ERK/ERK介导TGF-β1的效应。第二部分miR-21对内皮细胞发生内皮-间质转化的作用和机制研究【目的】内皮-间质转化(endothelial-mesenchymal transition,End MT)是肌成纤维细胞的来源之一。End MT通过内皮细胞失去固有特征性和获得的间充质细胞表型而来。本部分建立离体培养人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)模型,探讨miR-21对End MT的影响和机制。【方法】分离和培养HUVECs,建立TGF-β1诱导HUVECs发生End MT模型,转染miR-21 mimic,miR-21 inhibite以抑制或过表达miR-21。实验分为4组:正常对照组、TGF-β1组、miR-21-mimic组、TGF-β1+miR-21 inhibiter组。real-time PCR方法检测miR-21的表达。免疫荧光、免疫印迹检测内皮细胞标记物CD-31和间质细胞的标记物FSP-1的表达。【结果】TGF-β1上调HUVECs的miR-21的水平,与正常对照组相比有显著性差异(P<0.05);TGF-β1/miR-21能够诱导HUVECs发生End MT,表现为内皮细胞的标记物CD31表达降低(P<0.05),而间质细胞的标记物FSP-1表达增加(P<0.05);抑制miR-21能够部分抑制TGF-β1诱导的End MT。【结论】TGF-β1能够通过调控miR-21诱导HUVECs发生End MT;抑制miR-21能够部分抑制TGF-β1诱导的End MT。第三部分雷公藤红素对心肌成纤维细胞的调节作用和机制研究【目的】雷公藤红素是从雷公藤根部提取的一种有效的天然生物活性化合物。它已被证明在抗炎,抗癌,抗风湿和自身免疫性疾病方面非常有价值。研究发现雷公藤红素有心脏保护作用。miR-21参与调控CFs的增殖与活化。本部分研究旨在探讨雷公藤红素对CFs功能状态以及是否能够调控miR-21并且进行机制探讨。【方法】分离培养原代小鼠CFs,构建TGF-β1促细胞模型,雷公藤红素进行干预。随机分为正常对照组、TGF-β1组、TGF-β1+雷公藤红素组。real-time PCR方法检测miR-21的表达,免疫印迹法检测α-SMA、p ERK/ERK的表达;MTT法检测细胞增殖水平;El ASA法检测Ⅰ型胶原,Ⅲ型胶原的表达。【结果】MTT法检测CFs的增殖,分析数据发现雷公藤红素对CFs的抑制作用有浓度依赖性。用不同浓度的雷公藤红素(0.2,1,5μM)进行干预,能够抑制TGF-β1诱导的成纤维细胞的増殖水平增加,其中1μM和5μM浓度具有统计学意义(P<0.05)。与TGF-β1组相比,雷公藤红素组CFs培养液上清Ⅰ型胶原,Ⅲ型胶原水平降低(P<0.05,P<0.05),α-SMA的表达水平也降低(P<0.05);雷公藤红素能够抑制TGF-β1诱导的miR-21水平增加;TGF-β1组较正常对照组细胞p ERK/ERK的水平增加,差异具有统计学意义(P<0.05),而雷公藤红素组较TGF-β1组,p ERK/ERK表达显著降低(P<0.05)。【结论】本部分研究表明雷公藤红素能够抑制CFs增殖和活化,胶原的合成;雷公藤红素的作用可能与下调CFs的miR-21和p ERK/ERK信号通路有关。第四部分雷公藤红素对HUVECs发生内皮-间质转化的调节作用和机制研究【目的】探讨雷公藤红素对HUVECs发生End MT的作用和机制。【方法】分离和培养HUVEC,建立TGF-β1诱导HUVECs发生EndMT模型,雷公藤红素进行干预。将同批次原代HUVECs随机分为3组:正常对照组、TGF-β1组、TGF-β1+雷公藤红素组。real-time PCR方法检测miR-21的表达,免疫荧光、免疫印迹检测内皮细胞标记物CD-31和间质细胞的标记物FSP-1的表达;免疫印迹法检测炎症因子(ICAM-1、VCAM-1、TNF-a)的表达。【结果】TGF-β1通过上调HUVECs的miR-21的水平,诱导HUVECs发生End MT:下调内皮细胞特异性标记物CD31的表达,上调间质细胞特异性的标记物FSP-1表达。雷公藤红素能够抑制TGF-β1诱导miR-21表达的增加,抑制End MT的发生,表现为内皮细胞的特异性标记物CD31表达增加,而间质细胞特异性标记物FSP-1表达降低。雷公藤红素通过抑制HUVECs的miR-21的水平和炎症因子的表达,抑制TGF-β1的引起End MT效应。【结论】TGF-β1通过调控miR-21诱导HUVECs发生End MT;雷公藤红素通过抑制miR-21,抑制炎症相关因子的表达,能够改善TGF-β1诱导的End MT。第五部分雷公藤红素对压力超负荷动物心肌纤维化调节作用和机制研究【目的】雷公藤红素对体外培养CFs和HUVECs都有一定的保护作用,本部分研究观察雷公藤红素对压力超负荷动物心肌纤维化和心功能的影响,并进行机制探讨。【方法】研究选取C57BL/6小鼠,将实验动物随机分为假手术组、主动脉弓缩窄(transverse aortic constriction,TAC)模型组(TAC组)、雷公藤红素组(TAC+雷公藤红素)。应用主动脉弓缩窄方法建立压力超负荷致动物心肌纤维化模型。每天给药1次(1 mg/kg/d,腹腔注射),12周后进行检测。取心脏标本,进行HE染色、Masson染色和天狼猩红染色观察心肌组织学改变。real-time PCR方法检测各组实验动物心肌组织miR-21的表达;免疫印迹法检测a-SMA的表达。免疫印迹检测小鼠心肌中内皮细胞标记物(CD31)和成纤维细胞标志物(FSP-1)的表达,免疫荧光检测两者表达和共定位情况。检测各组实验动物p ERK/ERK的表达,炎症因子(ICAM-1、VCAM-1、TNF-a);采用超声心动图检测左心室舒张期前壁厚度(LVAWd)、左心室收缩期前壁厚度(LVAWs)、左心室舒张期后壁厚度(LVPWd)、左心室收缩期后壁厚度(LVPWs)、左心室重量、射血分数(EF)、左室短轴缩短率(FS)。El ASA法检测Ⅰ型胶原,Ⅲ型胶原的表达。【结果】与假手术组对比,模型组小鼠心肌组织HE染色,Masson染色以及天狼星红染色出现明显的心肌纤维化。与假手术组对比,模型组小鼠心肌组织胶原表达增加,Ⅰ、Ⅲ型胶原表达增加。模型组较假手术组心肌组织α-SMA表达的增加;与假手术组对比,TAC组小鼠心肌组织miR-21表达增加。与假手术组对比,TAC组小鼠心肌组织p ERK/ERK增加。模型组心肌组织可见End MT改变,模型组较假手术组内皮细胞的标记物CD31表达降低,而间质细胞的标记物FSP-1表达增加。与假手术组相比,模型组小鼠心肌组织的炎症因子TNF-a,促炎因子VCAM-1和ICAM-1的表达显著升高。与假手术组相比,TAC组小鼠心脏出现显著的心室壁增厚:左心室舒张期前壁厚度(LVAWd),左心室收缩期前壁厚度(LVAWs)、左心室舒张期后壁厚度(LVPWd)、左心室收缩期后壁厚度(LVPWs)增加,左心室重量增加。导致显著的心功能降低:射血分数(EF)显著降低,左室短轴缩短率(FS)显著降低。雷公藤素治疗能够显著改善上述心肌纤维化病理表现,心肌组织胶原沉积明显减轻。雷公藤素组Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原表达较TAC组降低;雷公藤红素组较模型组心肌组织α-SMA表达降低;雷公藤素组miR-21表达较模型组降低。雷公藤素组p ERK/ERK较模型组降低;雷公藤红素能够抑制对压力超负荷小鼠心肌组织发生End MT改变。雷公藤红素的干预抑制了压力超负荷引起的小鼠组心肌组织炎症反应,与模型组相比TNF-a、VCAM-1、ICAM-1的表达的升高。雷公藤素的干预显著改善了实验小鼠的心室壁增厚、心腔扩张以及心功能的降低。表现为与TAC组相比,左心室舒张期前壁厚度(LVAWd)、左心室收缩期前壁厚度(LVAWs)、左心室舒张期后壁厚度(LVAWd)、左心室收缩期后壁厚度(LVAWs)减低,左心室重量降低。反应心功能的指标:射血分数(EF)较TAC组增加,左室短轴缩短率(FS)较TAC增加。【结论】雷公藤红素能够改善压力超负荷诱导的心肌纤维化、End MT以及心功能受损。雷公藤红素对心肌纤维化和End MT的抑制作用可能与抑制miR-21、p ERK/ERK以及抑制炎症因子TNF-a,促炎因子VCAM-1和ICAM-1有关。