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小麦(Triticum aestivum L.)是世界上种植最广泛的粮食作物,大约有40%的人口以小麦作为主食。小麦为世界人口提供20%的能量和25%左右的蛋白质。春化基因(VRN)和光周期基因(PPD)对小麦的生殖生长起重要调控作用,这两个基因的等位多样性决定了小麦对环境的广适性。小麦VRN2基因被认为是主要的开花抑制因子,在冬季低温环境中防止冬小麦开花,但低温(春化)可以降低该基因的表达,消除该基因对开花的抑制作用,使冬小麦品种能够在次年春季开花。小麦VRN2基因座位包括ZCCT1和ZCCT2两个串联的基因。虽然研究认为小麦ZCCT1基因是小麦春化的相关基因,ZCCT2基因与开花有关,但目前没有证据证明ZCCT2是小麦春化相关基因,其功能尚不明确。本研究分别构建了ZCCT1和ZCCT2两个基因在小麦A、B、D三个染色体组上的单靶点敲除载体、多靶点敲除载体、过表达载体以及沉默载体,利用农杆菌介导转基因技术,以期初步分析ZCCT2基因在小麦中的功能,明确ZCCT2与小麦冬性强弱的关系,将有助于评价品种适应性以及分子标记辅助育种。主要结果如下:1.单靶点敲除载体构建:利用在线靶点设计网站,设计六条评分较高、特异性较好的ZCCT1、ZCCT2基因的靶点,构建了六个单靶点敲除载体,使用热激法导入EHA105农杆菌感受态细胞。2.多靶点敲除载体构建:利用在线靶点设计网站,设计十二条评分较高、特异性较好的ZCCT1、ZCCT2基因的靶点序列,构建了六个多靶点敲除载体,使用热激法导入EHA105农杆菌感受态细胞。3.过表达载体与沉默载体构建:使用高保真酶扩增目的基因片段,导入表达载体,分别构建了六个过表达载体和六个沉默载体。4.原生质体验证:将多靶点表达载体ZCCT1-A1-U6、ZCCT1-D1-U6、ZCCT2-A2-U6、ZCCT2-B2-U6、ZCCT2-D2-U6载体导入提取的小麦原生质体。原生质体提取计数符合要求,在荧光显微镜下观察,能够观察到绿色荧光,说明质粒成功转化进入原生质体,但转化效率比较低。5.利用农杆菌介导转基因技术转化冬小麦科农199,共获得30株单靶点敲除载体转基因植株。对转基因植株进行开花习性调查,科农199作为冬性品种,本应经历春化过程才能从营养生长变为生殖生长。在获得的30株单靶点敲除载体转基因小麦植株中,发现9株转基因植株在经过转基因事件后未经历春化过程进入生殖生长,且成功收获种子。21株未经春化一直处于营养生长状态直到黄化死亡或者能够抽穗但无结实。