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成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factors，FGFs）及其受体（fibroblast growthfactor receptors，FGFRs）在骨骼发育中发挥重要作用，其功能增强型突变可导致包括软骨发育不全（Achondroplasia,ACH）、颅缝早闭（craniosynostosis，CS）等在内的多种人类骨骼遗传病。FGFRs属于酪氨酸激酶受体家族，目前发现有4个成员，均由胞外的配体结合区、跨膜区和胞内高度保守的信号转导区三部分构成。类似其它酪氨酸激酶受体，FGFRs在与配体FGFs结合后，发生二聚化反应激活FGFRs胞内段的酪氨酸激酶活性，从而经Ras-MAPK、PI3K-AKT及PLC-γ等通路向下游传递信号，发挥生物学功能。FGFR2是FGFRs家族参与骨骼发育过程的重要成员，主要在颅缝成骨前体细胞、成骨细胞及长骨骨膜中表达。FGFR2两种功能增强型点突变（S252W、P253R）可引起Apert综合征，表现为冠状缝早闭、短头畸形、颅面发育不良并伴严重的并指。FGFR2跨膜区功能降低型突变则引起BBD综合征（Bent Bone Dysplasia，BBD），患者表现为颅缝早闭、面部发育畸形及长骨弯曲。Fgfr2敲除小鼠在胚胎期10.5天死亡，出现包括颅骨和肢体（limb）在内的多个器官发育障碍。间质细胞条件敲除Fgfr2小鼠表现为头颅畸形、体型矮小、生长迟缓、骨密度下降。上述结果提示FGFR2在骨骼发育特别是颅骨发育中发挥着重要作用。颅骨缺损后再生修复在一定程度上是局部颅骨的再发育过程，多种调控骨骼发育的分子如Wnts、FGFs、BMPs等都参与颅骨缺损后再生修复过程。鉴于FGFR2在骨骼发育特别是颅骨发育中的重要作用，FGFR2可能参与了颅骨缺损后的再生修复过程，但其具体作用及详细机制不清。为了探索FGFR2在其中的作用及相关机制，我们基于CreER(T2)-Loxp系统建立了成年期FGFR2P253R/+诱导增强小鼠，在排除早期发育对成骨影响的基础上，通过建立颅骨缺损模型观察FGFR2对颅骨损伤修复的影响并探讨其可能的机制。机械性骨髓消融（Mechanical bone marrow ablation，BMX）可引起损伤后骨髓腔内膜内成骨过程，可较好的用于研究基因在骨形成和骨重建中的作用。因BMX后的骨形成和颅骨缺损后的骨再生过程均为膜内成骨过程，我们进一步在第二部分利用BMX模型，研究FGFR2对骨形成的影响，可从另一侧面验证FGFR2在颅骨缺损修复中的作用。方法：第一部分：FGFR2在颅骨缺损修复中的作用和机制研究1．建立FGFR2P253R/+诱导增强小鼠颅骨缺损模型；2．利用Micro-CT实时动态观察颅骨缺损后2周、4周、8周缺损愈合过程，并定量测量缺损愈合面积；利用X线摄片观察颅骨缺损后8周缺损愈合情况；3．组织病理H.E染色观察颅骨缺损后8周缺损边缘骨形成情况；4．定量PCR检测颅骨缺损后两周颅骨成骨分化相关基因Runx2、ColI、OP、OC的表达变化；5．FGFR2P253Rneo/+;EIIa-Cre小鼠颅骨成骨细胞分离培养，细胞计数及MTT测定增殖情况；FGFR2P253Rneo/+;CMV-CreER(T2)成骨细胞4-羟基他莫昔芬处理后，经成骨诱导分化，通过ALP染色和定量PCR检测成骨分化相关基因Runx2、ColI、OP、OC的表达观察成骨分化情况；Western Blot检测磷酸化ERK1/2蛋白水平变化；6．定量PCR检测成骨诱导14天后经典Wnt/β-catenin通路相关基因Dvl2、β-catenin、Tcf-1的表达。第二部分：FGFR2功能增强对BMX后骨形成的影响1．通过X线摄片和Micro-CT观察BMX后1周和2周骨形成情况；2．通过H.E染色和成骨细胞形态计量观察BMX后1周和2周成骨细胞的功能活性；3．定量PCR检测BMX后2周成骨分化相关基因Runx2、ColI、OP、OC的表达；4．通过TRAP染色和破骨细胞形态计量观察BMX后1周和2周破骨细胞的功能活性；5．定量PCR检测BMX后2周TRAP、CTSK、RANKL、OPG表达及RANKL/OPG的比值。结果：一、FGFR2P253R/+诱导增强小鼠颅骨缺损愈合加快，成骨能力增强1．Micro-CT扫描显示颅骨缺损后2周、4周、8周，FGFR2P253R/+诱导增强小鼠缺损未愈合面积较野生小鼠减少，定量测量显示颅骨缺损后8周FGFR2P253R/+诱导增强小鼠缺损愈合百分比明显高于野生小鼠；H.E染色显示颅骨缺损后8周FGFR2P253R/+诱导增强小鼠缺损边缘新生骨组织较野生小鼠多；2．定量PCR结果显示颅骨缺损后2周，FGFR2P253R/+诱导增强小鼠缺损周围骨组织Runx2、ColI、OP、OC的表达较野生小鼠高；3．FGFR2P253R/+功能增强颅骨成骨细胞增殖加快、分化增强；（1）细胞计数及MTT检测提示FGFR2P253R/+功能增强颅骨成骨细胞增殖加快；经成骨诱导后ALP活性增加，成骨分化相关基因Runx2、ColI、OP表达上调。（2）FGFR2P253R/+功能增强颅骨成骨细胞磷酸化ERK1/2蛋白水平升高。（3）FGFR2P253R/+功能增强颅骨成骨细胞经典Wnt/β-catenin信号通路中Dvl2、Tcf1表达上调，β-catenin表达不变。二、FGFR2P253R/+诱导增强小鼠BMX后骨形成增加、骨吸收过程延迟。1．X线和Micro-CT扫描显示BMX后1周和2周FGFR2P253R/+诱导增强小鼠骨形成增加。2．H.E染色和成骨细胞形态计量显示BMX后1周和2周FGFR2P253R/+诱导增强小鼠新生骨组织中成骨细胞数增加，定量PCR结果显示BMX后2周FGFR2P253R/+诱导增强小鼠新生骨组织中成骨分化相关基因Runx2、ColI、OC表达上调。3．TRAP染色和破骨细胞形态计量显示BMX后1周FGFR2P253R/+诱导增强小鼠破骨细胞活性较野生小鼠低，而BMX后2周，FGFR2P253R/+诱导增强小鼠破骨细胞活性却较野生小鼠高；同时野生小鼠破骨细胞活性在BMX后1周较高，第2周明显降低，相反，FGFR2P253R/+诱导增强小鼠破骨细胞活性在BMX后2周较高，提示FGFR2P253R/+诱导增强小鼠BMX后骨吸收过程延迟。结论：1．FGFR2功能增强促进小鼠颅骨缺损的愈合和成骨活性；2．FGFR2功能增强促进颅骨成骨细胞的增殖；FGFR2功能增强促进了Runx2的表达，继而上调ColI、OP的表达促进颅骨成骨细胞的分化；这一作用可能部分通过激活ERK1/2MAPK信号通路实现的；3．FGFR2功能增强可能通过经典Wnt/β-catenin信号通路促进成骨细胞的分化；4．FGFR2功能增强促进BMX后的骨形成，同时延迟了BMX后的骨吸收过程。