论文部分内容阅读
西瓜、甜瓜、黄瓜、和南瓜等葫芦科作物是世界重要的经济作物。这些作物能被小西葫芦黄化花叶病毒（ZYMV）、西瓜花叶病毒-2号（WMV-2）、黄瓜花叶病毒（CMV）严重毁坏。虽然这些病毒不能使葫芦科瓜类作物死亡，但能为害它们自然生长过程，使果实产生畸形甚至绝产。我们从安徽合肥市郊区的西瓜病叶上分离出一病毒分离物代号为HF-WX。通过人工接种6科15种植物，结果发现有3科9种植物发病，其中西瓜Citrllus lanatus、南瓜Cucurbita moschata、西葫芦Cucurbita pepo表现黄化、花叶；苋色藜Chenopodium amaranticolor和千日红Gomphrena globosa表现局部褪绿斑。该分离物汁液钝化温度60～65℃，稀释限点为10-4～10-5，寄主体外存活期为20～23d。电镜观察病毒粒体为线状，长×宽=750nm×13nm，A260/A280的比值为0.84，病毒RNA含量为5.5％左右。该分离物与标准ZYMV抗血清及HF-WX抗血清呈阳性反应，与WMV-2、CMV、烟草花叶病毒（TMV）、南瓜花叶病毒（SqMV）抗血清呈阴性反应。与国内报道的ZYMV生物学特性极为相似。将分离物HF-WX在繁殖寄主西葫芦（早丰一号）上繁殖。用分离物HF-WX提纯物免疫母鸡和兔子，分别从母鸡蛋卵黄和兔子抗血清中提取免疫球蛋白IgY和IgG。测得IgY和HF-WX抗血清的效价为1/512和1/1024。蚜虫传毒实验表明，不同蚜虫种类对FH-WX的传播能力存在差异，传毒率为桃蚜>菜蚜>棉蚜、麦蚜。由于WMV-2与ZYMV生物学特性很相似，所以仅通过生物学检测很难区分WMV-2与ZYMV。为进一步确定分离物HF-WX的种类，我们进行了分子生物学研究。参考已发表的WMV-2序列（GenBank 登录号AB001994）和 ZYMV序列（GenBank 序列号AF435425）分别设计引物ZH1、ZH2和ZH4、ZH5，并进行PCR扩增。以ZYMV为引物的PCR反应获得840bp大小的目的片段，而以WMV-2为引物的PCR反应未得到目的片段。将PCR产物经XbaI、BamHI双酶切后，定向连接到质粒pGEM-3Zf(+)中，再转化入大肠杆菌Jm109中。以碱法提取质粒，分别以PCR法和双酶切法筛选阳性重组质粒pGEM-3Zf(+)/ZYMV- CP。挑取3个阳性克隆进行测序，测序结果完全一致，说明不存在由于DNA聚合酶引起的错配碱基，证明得到了准确CP基因序列。将分离物HF-WX CP基因序列登录GenBank,登录序列号为AY597207。分析CP基因序列并推导氨基酸序列发现：CP基因全长840nt，共编码279个氨基酸，与国内外报道的ZYMV-CP基因的核苷酸序列同源性为83.0%～97.3%，氨基酸序列的同源性为91.8%～99.8%。与GenBank中登录序列号为AF486823海南<WP=4>分离物同源性最高，核苷酸序列为97.3%，氨基酸同源性为99.8%。其中应用序列分析的16个ZYMV CP基因cDNA序列引自GenBank：AF435425、AF486822、AF486823、AF513551、AF513550、AF513552、AY074808、AY074809、AY074810、AJ429071、AJ459954、AJ459955、AJ459956、AB063251、D00692、D13914。应用DNAMAN软件以邻接法构建系统树，从核苷酸序列及氨基酸序列亲源关系角度分析各分离物间亲缘关系。将分离物HF-WX的复制酶、蛋白酶、VPg蛋白基因分为S1、S2、S3三个片段，长度均为1kp。根据已发表的ZYMV序列（GenBank 序列号AF127929），在S1、S2、S3三个片段的两端设计合成引物，并进行PCR扩增。琼脂糖凝胶分析表明,获得1kb大小的片段,与预期大小相符。通过以上生物学特性和分子水平的研究，可以确定分离物HF-WX为ZYMV。