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目的:组蛋白修饰是表观遗传调控中的重要内容,组蛋白修饰异常与许多疾病发生发展有关。有关肝纤维化病理改变中组蛋白修饰的作用目前还不清楚,为此,本研究观察在四氯化碳(CCl4)致大鼠肝纤维化后大鼠肝组织中组蛋白修饰的变化及大鼠原代肝星状细胞(HSCs)自发活化中组蛋白修饰的改变,探讨组蛋白修饰变化在肝纤维化发生机制中的变化及可能的作用。方法:(1)雄性Wistar大鼠20只,180 g~200 g,随机分为正常对照组和肝纤维化组。肝纤维化组用40%CCl4植物油溶液0.3 ml/100 g皮下注射,间隔三天注射一次以制备大鼠肝纤维化模型,正常组大鼠皮下注射等量植物油溶液。实验8周末杀鼠,取两组大鼠肝脏,测定肝脏指数;取肝组织常规固定,HE染色、Masson染色观察组织病理改变及胶原纤维沉积情况;western blot检测并比较两组大鼠肝脏组织α-SMA、?型胶原表达情况以及acH4K12、acH3K9、H3K4me2和H3K9me2修饰水平变化。(2)胶原酶循环灌注结合密度梯度离心的方法分离大鼠HSCs,细胞免疫荧光法检测desmin阳性细胞数以鉴定HSCs,光镜观察HSCs自发活化过程中形态变化、western blot检测HSCs自发活化过程中α-SMA、desmin的表达,确定HSCs活化;以western blot分别检测比较静止型HSCs和激活型HSCs中acH4K12、acH3K9、H3K4me2和H3K9me2修饰水平变化。结果:(1)40%CCl4植物油溶液0.3 ml/100 g皮下注射8周后,注射组大鼠肝脏指数明显高于正常组大鼠肝脏指数(5.98±0.69/3.81±0.17,P<0.01);病理学检查提示注射组大鼠肝组织内大量炎性细胞浸润,肝脏纤维结缔组织明显增多,部分区域有假小叶形成,根据王宝恩肝纤维化分级发现注射组大鼠肝纤维化程度明显高于对照组大鼠,提示40%CCl4植物油溶液0.3 ml/100 g皮下注射8周后,注射组大鼠肝纤维化形成。肝纤维化标志物检测发现注射组大鼠肝脏中α-SMA、?型胶原表达明显较正常组高(P<0.01),这些结果表明大鼠肝纤维化模型复制成功。(2)以western blot检测并比较两组大鼠肝脏组织中acH4K12、acH3K9、H3K4me2和H3K9me2修饰水平发现,与正常组大鼠相比,肝纤维化组大鼠肝组织中acH4K12修饰水平减少(1.11±0.19/0.55±0.27,P<0.01),acH3K9、H3K9me2修饰水平明显增加(0.379±0.01/2±0.20,P<0.01;0.277±0.03/1.6±0.23,P<0.01),H3K4me2修饰水平有所增加但差异无统计学意义(0.456±0.12/0.586±0.24,P>0.05)。(3)用胶原酶循环灌注结合密度梯度离心法提取大鼠原代HSCs培养24 h后,免疫荧光检测HSCs中desmin表达,发现desmin阳性的细胞大于90%,提示细胞纯度大于90%。光镜下观察发现,刚分离的HSCs呈折光性很强的圆球形,培养6 h后细胞基本贴壁,胞质内含大量折光性强的颗粒;培养24 h后HSCs开始伸出伪足,培养4~5 d后HSCs细胞继续伸展,形态逐渐变成梭形,融合成片,胞质内折光性强的颗粒逐渐减少;培养第10~15 d时,绝大多数细胞呈典型星形,融合成片,细胞内折光性颗粒消失。(4)进一步用western blot检测结果显示,分离培养24 h的HSCs表达desmin,但几乎不表达α-SMA;随着培养时间延长,4~5 d后HSCs内desmin表达开始逐渐增加而α-SMA表达逐步增加,至培养15 d时HSCs内α-SMA表达水平达到峰值,提示培养15天HSCs完全活化。根据HSCs细胞形态变化及HSCs活化标志蛋白检测结果,本实验初步确定培养24 h HSCs为静止型HSCs,培养15d HSCs为激活型HSCs。(5)western blot检测静止型和激活型HSCs中acH4K12、acH3K9、H3K4me2和H3K9me2修饰水平,结果显示:与静止型HSCs比较,acH4K12、acH3K9、H3K9me2修饰水平明显降低(0.162±0.012/0.035±0.010,P<0.01;0.430±0.056/0.235±0.024,P<0.01;0.159±0.007/0.036±0.007,P<0.01),其中acH4K12修饰水平变化与肝纤维化大鼠肝组织检测结果一致,而acH3K9、H3K9me2修饰水平则与体内结果相反;与肝纤维化组大鼠肝组织中H3K4me2表达有所增加,但差异无显著性意义不同,H3K4me2修饰水平在激活型HSCs中较静止型HSCs明显增加(0.155±0.012/0.289±0.007,P<0.01),且与α-SMA表达逐渐增加的变化趋势一致。结论:我们的研究表明,肝纤维化大鼠肝组织acH4K12修饰水平减少,acH3K9、H3K9me2修饰水平明显增加,提示acH4K12、acH3K9、H3K9me2修饰水平改变可能参与了大鼠肝纤维化发生机制,推测肝纤维化发生中肝脏组蛋白修饰的改变可能与某些细胞外基质代谢相关基因转录调控有关。进一步对HSCs自发活化的研究表明,组蛋白acH4K12修饰水平减少和H3K4me2修饰水平增加可能参与了HSCs活化、细胞外基质增多的调控。