论文部分内容阅读
子宫内膜炎是奶牛产后最常见的疾病。虽然前列腺素E2(prostaglandin E2,PGE2)在子宫内膜炎等多种炎症性疾病中出现蓄积,但其与奶牛子宫内膜上皮组织损伤的关系尚不清楚。为了探明蓄积的PGE2在脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导的体外培养奶牛子宫内膜上皮组织损伤中的作用,本研究检测了采用环氧合酶2(cyclooxygenase-2,COX-2)抑制剂 CAY10404和 NS3 98 抑制 PGE2 的分泌与合成,以及 15-羟前列腺素降解酶(15-hydroxyprostaglandin dehydrogenase,15-PGDH)抑制剂以抑制PGE2的分解,促进PGE2蓄积,即从抑制和促进两方面去验证蓄积的PGE2与LPS诱导下奶牛子宫内膜组织分泌与合成或释放的炎性细胞因子、损伤相关分子模式(damage related molecular patterns,DAMPs)以及信号通路的相关因子的表达情况之间的关系,从而验证蓄积的PGE2起到炎症介质的作用,从而促进炎症的发生。上述结果为合理应用非甾体类药治疗奶牛子宫内膜炎以及相关疾病提供依据。具体研究内容如下:1.LPS对奶牛子宫内膜上皮组织损伤的相关研究。采用RT-qPCR、Western Blot、Elisa和免疫荧光(immunofluorescence,IF)方法检测LPS诱导下奶牛子宫内膜上皮组织内PGE2及相关限速酶环氧合酶2(cyclooxygenase-2,COX-2)、膜结合前列腺素合成酶 1(membrane bound prostaglandin E synthetase,mPGES-丨)),炎性细胞因子((白细胞介素6(interleukin 6,IL-6)、肿瘤坏死因子a(tumor necrosis factor a,TNF-a)和诱导型一氧化氮合成酶/一氧化氮(inducible nitric oxide synthase/nitric oxide,iNOS/NO))以及损伤相关分子(damage associated molecule patterns,DAMPs)透明质烷结合蛋白1(hyaluronan binding protein 1,HABP1)和高迁移率蛋白1(high mobility group box-1,HMGB1)的表达变化情况。结果显示LPS可造成奶牛子宫内膜上皮组织的损伤,且可诱导奶牛子宫内膜上皮组织内PGE2、COX-2、mPGES-1、IL-6、TNF-a、iNOS/NO、HABP1和HMGB1的等炎症相关因子的高表达。2.COX-2抑制剂CAY10404和NS-398对LPS诱导的奶牛子宫内膜损伤影响的相关研究。先用CAY10404和NS398预处理奶牛子宫内膜上皮组织后,采用RT-qPCR、Western Blot、Elisa和IF方法检测LPS诱导后相关因子的变化情况,结果显示PGE2和COX-2出现了明显的下降,IL-6、TNF-α和iNOS/NO合成与分泌受到抑制,HABP1和HMGB1的表达(或合成)出现下降。这些结果说明经COX-2催化生成的PGE2参与了由LPS刺激产生的促炎症因子和DAMPs的过程,即蓄积的PGE2作为炎症介质促进了组织损伤过程的发生。3.蓄积的PGE2促进奶牛子宫内膜损伤的相关机制研究。本试验预先给予15-羟前列腺素脱氢酶(15-hydroxyprostaglandin dehydrogenase,15-PGDH)抑制剂以抑制PGE2的分解,使PGE2呈蓄积,采用RT-qPCR、Westem Blot、Elisa和IF方法检测LPS诱导后相关指标的变化。研究结果显示COX-2、IL-6和TNF-α的表达升高,这印证了蓄积的PGE2起到炎症介质的作用。同时,前列腺素E2受体4(prostaglandin E2 receptor 4,EP4)、toll样受体4(toll-like receptor 4,TLR4)和髓样分化因子88(myeloid differentiation factor 88,MyD88)表达升高,印证了蓄积的PGE2参与LPS诱导的奶牛子宫内膜炎症应答是通过PGE2-EP4影响TLR4-MyD88途径而发挥作用。研究结果还表明LPS诱导蓄积的PGE2可以激活环磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate,cAMP)依赖性蛋白激酶A(protein kinase A,PKA)、丝裂原激活化的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPKs)和核转录因子κB(nuclear transcription factor-κB,NF-κB)的相关信号转导分子蛋白的磷酸化进而激活下游相关的信号通路,最终导致炎症的发生。总体结论:1.通过病理组织切片可知,100ng/mLLPS可诱导奶牛子宫内膜上皮组织损伤,通过COX-2和mPGES-1促进子宫内膜上皮组织PGE2合成和分泌,促进炎性细胞因子和DAMPs表达;2.LPS诱导的奶牛子宫内膜上皮组织中PGE2的升高主要通过PGs关键合成酶COX-2调节,COX-2抑制剂可导致奶牛子宫内膜炎性细胞因子和DAMPS表达下降,COX-2抑制剂可促进奶牛子宫内膜上皮组织修复因子表达。3.当15-PGDH抑制剂与LPS刺激奶牛子宫内膜上皮组织时,可促进PGE2的升高及其关键合成酶、炎性细胞因子和DAMPS的表达升高,LPS诱导的奶牛子宫内膜上皮组织可以通过PGE2-EP4途径影响TLR4-MyD88途径而发挥作用,并通过PKA、MAPKs和NF-κB信号通路的激活,促进炎症进程。