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目的:研究HepG22.2.15细胞内HBV复制过程中fxRNA、trxRNA转录,xDNA复制及HBcAg/HBeAg表达等状况,并构建xDNA的竞争子。
方法:收集培养9天的HepG22.2.15细胞,一部分细胞用试剂盒分别提取细胞内总RNA和DNA,以RT/AP-PCR、PCR技术分别扩增fxRNA、trxRNA和xDNA,并以xDNA为模板,以PCR技术构建其竞争子;一部分以免疫组化和Westernblot技术检测细胞内HBcAg的表达。实验同时以HepG2细胞为阴性对照。
结果:HepG22.2.15细胞内可持续检出HBVfxRNA、trxRNA、xDNA,但HBcAg尚未检出;第3-21天HBeAg在第6天有一短暂下降,以后随培养时间延长呈上升趋势。成功构建了xDNA的竞争子L180。
摘要
目的:研究PMEA(阿地福韦酯)细胞内抗乙肝病毒(HBV)作用效果。
方法:以8μg/mlPMEA对HepG22.2.15细胞连续作用9天(每3天更换一次药液)后,经MTT法确认此浓度PMEA无胞毒作用,收获加药组和未加药组细胞并提取细胞内总RNA、DNA,用竞争RT/AP-PCR和竞争PCR分别对HBVfxRNA、trxRNA和xDNA定量分析。另外以相同浓度PMEA连续作用HepG22.2.15细胞21天,每3天也更换并收集一次药液,-20℃保存,最后用HBeAgELISA试剂盒检测HBeAg量的变化。
结果:8μg/mlPMEA对fxRNA、trxRNA无抑制作用,对xDNA有抑制作用,抑制率为46.58%。另外8μg/mlPMEA对细胞上清HBeAg的抑制作用随作用时间延长而加强。