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细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine-induced killer cells,CIK)治疗能有效抑制慢性乙型肝炎(chronic hepatitis b,CHB)患者体内乙型肝炎病毒(hepatitis b virus,HBV)的复制,被认为是一种有效的治疗CHB的过继免疫治疗策略。然而,由于个体差异的存在以及部分CHB患者处于免疫抑制状态,部分CHB患者来源的CIK细胞数量少,抗HBV效果差。共刺激基因工程细胞(engineered cells for costimulatory enhancement,ECCE)是稳定表达4-1BBL的K562细胞系,能与T细胞表面的4-1BB结合促进T细胞的增殖。本研究将ECCE加入CIK的培养体系共培养,获取了共刺激基因工程细胞共培养的细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine-induced killer cells enhanced by engineered cells for costimulatory enhancement,ECCE-CIK),并检测了ECCE-CIK的表型、对肿瘤细胞株的杀伤能力及细胞因子的分泌。随后,我们培养了CHB患者来源的ECCE-CIK,并检测了其对HepG2.2.15中HBV的抑制作用。【目的】1.构建ECCE-CIK,检测其增殖、表型、对肿瘤细胞株的杀伤功能及细胞因子分泌,为改进CIK的培养提供新方法。2.初步探索CHB患者来源的ECCE-CIK对人肝癌细胞系HepG2.2.15中HBV的抑制作用,为ECCE-CIK用于治疗CHB提供实验依据。【方法】1.采集10名健康人外周血。采用密度梯度离心法分离外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMC)。使用干扰素-γ(Interferon-γ,IFN-γ)、CD3单抗、白介素-2(Interleukin-2,IL-2)细胞因子刺激PBMC诱导产生传统CIK。将被γ射线辐照过的ECCE以不同比例与健康人PBMC混合,然后加入IFN-γ、CD3单抗及IL-2诱导,优化培养体系,建立ECCE-CIK体外培养方法。随后,比较传统CIK和ECCE-CIK增殖能力,采用流式细胞术分析其细胞表型,采用CFSE/PI染色法、CCK-8检测法检测细胞杀伤肿瘤细胞株的功能,采用ELISA检测其细胞因子的分泌。2.采集10名CHB患者的外周血,培养获取ECCE-CIK,随后,将ECCE-CIK与靶细胞HepG2.2.15在体外直接与间接共培养系统中分别共培养3h、24h、48h(在直接共培养系统中,ECCE-CIK和HepG2.2.15直接接触;在间接共培养系统中,ECCE-CIK和HepG2.2.15由一个0.4μm半透膜分隔,由ECCE-CIK产生的可溶性因子通过隔膜作用于HepG2.2.15),采用乳酸脱氢酶释放法(lactate dehydrogenase release assay,LDH)检测细胞毒作用,采用实时定量PCR方法检测HBV DNA,化学发光微粒子免疫分析法检测HBsAg,ELISA法检测IFN-γ、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor recept,TNF-α)含量。【结果】1.以健康人来源的PBMC 1×10^5/ml为起始浓度,培养至第21d时,传统CIK组的扩增倍数是73.79±7.28(PBMC(10^5)),ECCE-CIK组的扩增倍数分别是398.05±36.37(ECCE:PBMC=1:1)和567.23±108.30(ECCE:PBMC=10:1)。以健康人来源的PBMC 1×10^6/ml为起始浓度,培养至第21d时,传统CIK组的扩增倍数是523.51±62.81(PBMC(10^6)),ECCE-CIK组的扩增倍数分别是2856.21±94.17(ECCE:PBMC=1:10)和4123.25±158.54(ECCE:PBMC=1:1)。与传统CIK相比,健康人来源的ECCE-CIK的扩增倍数明显增高,差异具有统计学意义。其中,PBMC以1×10^6/ml为起始浓度,ECCE:PBMC=1:1组ECCE-CIK扩增倍数最高。2.健康人来源的ECCE-CIK中的CD3~+CD8~+细胞亚群占78.2%±4.6%,而传统CIK中CD3~+CD8~+细胞占65.9%±5.7%,P<0.01;ECCE-CIK中CD3~+CD56~-细胞亚群占43.5%±4.2%,传统CIK中CD3~+CD56~-细胞占37.8%±3.6%,P<0.01。3.健康人来源的ECCE-CIK对人肿瘤细胞系SMMC7721、MGC803、A375、A549的杀伤作用随着效靶比的增加而逐渐增强,并优于传统CIK。效靶比为20:1,作用3h,当以SMMC7721为靶细胞时,ECCE-CIK和传统CIK的杀伤效率分别为83.2%±3.5%和20.5%±4.3%(P<0.01);以MGC803为靶细胞,ECCE-CIK和传统CIK的杀伤效率分别为48.7%±5.5%和20.4%±6.3%(P<0.01);以A375为靶细胞,ECCE-CIK和传统CIK的杀伤效率分别为53.6%±4.5%和22.3%±3.3%(P<0.01);以A549为靶细胞,ECCE-CIK和传统CIK的杀伤效率分别为53.5%±3.5%和23.6%±4.3%(P<0.01)。4.健康人来源的ECCE-CIK及传统CIK分别与肿瘤细胞SMMC7721混合培养2h后,ECCE-CIK分泌的IFN-γ明显高于传统CIK(1090.99±127.52 pg/ml VS 396.58±49.1 pg/ml,P<0.01);ECCE-CIK分泌的TNF-α亦高于传统CIK(732.71±234.49 pg/ml VS 117.41±30.01 pg/ml,P<0.01)。5.CHB患者来源的ECCE-CIK扩增倍数明显高于传统CIK。培养至第20d,ECCE-CIK的扩增倍数是1563.76±186.55倍,传统CIK的扩增倍数是228.53±65.82倍,二者差异具有统计学意义。ECCE-CIK中CD3~+CD8~+细胞亚群比例比传统CIK高(90.5%±13.6%VS 80.3%±8.3%,P<0.05)。6.当CHB患者来源的ECCE-CIK与HepG2.2.15直接共培养时,随着效靶比的增加、时间的延长,ECCE-CIK对HepG2.2.15的杀伤效率逐渐增加。当作用时间为24h时,效靶比为1:1、5:1、10:1的杀伤效率分别是23.6%±2.6%、63.9%±5.3%、98.2%±2.0%,差异具有统计学差异。当效靶比为5:1时,共培养3h、24h、48h的杀伤效率分别是23.5%±2.5%、63.9%±5.3%、95.6%±2.5%,三者两两比较均具有统计学差异。当ECCE-CIK与HepG2.2.15间接共培养时,各实验组ECCE-CIK的杀伤效率均低于2%。7.直接共培养系统及间接共培养系统中,随着效靶比增加、共培养时间的延长,CHB患者来源的ECCE-CIK对HepG2.2.15分泌的HBV DNA及HBsAg的抑制率均逐渐增加。两组培养系统相比,对应各组间HBV DNA及HBsAg的抑制率差异无统计学意义。8.CHB患者来源的ECCE-CIK与HepG2.2.15共培养时,直接共培养系统中IFN-γ及TNF-α的分泌量随着效靶比增加而增加。间接共培养系统中IFN-γ和TNF-α的分泌量与直接共培养系统相似。两组培养系统相比,对应各组间IFN-γ、TNF-α的分泌量无差异。【结论】1.ECCE能够明显增强健康人来源CIK的体外增殖能力,生成ECCE-CIK。与传统CIK相比,ECCE-CIK的效应细胞CD3~+CD8~+亚群的比例增加,同时细胞杀伤肿瘤细胞株的功能和分泌细胞因子IFN-γ和TNF-α能力增强。2.ECCE能够明显增强CHB患者来源CIK的体外增殖能力,生成CHB患者来源的ECCE-CIK,其能够以HBV非特异性、直接接触方式杀伤HepG2.2.15细胞,且杀伤效率随效靶比的增加和时间的延长而增加。3.CHB患者来源的ECCE-CIK能通过非细胞裂解方式体外抑制HepG2.2.15细胞中HBV的复制,且抑制作用随效靶比的增加和作用时间的延长而增加。4.CHB患者来源的ECCE-CIK能分泌细胞因子IFN-γ、TNF-α,其可能是ECCE-CIK抑制HepG2.2.15细胞中HBV复制的主要效应分子。