研究背景多形性胶质母细胞瘤(GBM)起源于星形细胞或星形胶质祖细胞,是成人常见的中枢神经系统恶性肿瘤,在WHO颅内肿瘤分类中属星形细胞肿瘤Ⅳ级。因其具有高增殖和侵袭性行为,病情进展迅速,预后差。结合药物化疗和放射治疗的手术治疗是经典的治疗方法,然而化疗的毒性反应、耐药问题以及放疗副反应大,均导致目前多形性胶质母细胞瘤治疗手段上尚无突破性进展。在多形性胶质母细胞瘤的发生过程中,涉及到许多基因水平的改变,如癌基因的激活和放大,生长因子和(或)其受体的活化等。近年来,有学者针对胶质瘤的代谢、信号转导和细胞通路上的重要靶点进行了深入研究,结果发现：原发性GBM患者常有内皮生长因子受体(EGFR)的扩增和突变、染色体10q杂合性缺失、抑癌基因PTEN变异和P16的缺失等。针对恶性胶质瘤癌基因的活化、细胞增殖、凋亡、血管生成或迁移相关的蛋白质的过度表达,许多学者采用了不同的靶向治疗方案,并取得了一些进展,显示了基因靶向治疗具有良好的应用前景。USP22基因是近年发现的BMI-1通路上11个标记基因中的一个,在人体各组织中均有表达,表达量不等,其编码的蛋白质属于具有泛素特异性修饰酶家族。已有研究表明,BMI-1信号转导通路上的包括USP22在内的11个基因具有干细胞样表达模式,在正常干细胞和部分高度恶性肿瘤细胞中均有表达,与肿瘤的短期内复发、远处转移和治疗耐受密切相关,符合这种转录模式的癌症患者在肿瘤早期就表现出高度恶性的临床行为。USP22作为能够早期判断病情和预测疗效的肿瘤干细胞标记基因之一,其作用逐渐被认识。近年来的研究让我们有理由推测USP22高表达可能是胶质母细胞瘤错综复杂的转录调控途径中的关键点之一,也是潜在的治疗靶点。研究方法第一部分：通过RT-PCR和western blot技术检测USP22在正常脑组织和胶质母细胞瘤中的表达。第二部分：将病理证实为多形性胶质母细胞瘤的组织使用酶消化法进行原代细胞培养；设计并合成三对siRNA,分别转染原代培养细胞,通过RT-PCR和western blot技术检测siRNA干扰后USP22的表达,筛选出干扰效果最佳的一对；用筛选出的siRNA转染原代培养GBM细胞,利用MTT试验,验证RNA干扰对原代培养细胞活性的影响；进而用流式细胞仪检测USP22-specific siRNA对细胞周期的影响,并用Annexin V-FITC和PI双染色检测细胞凋亡情况；初步探索参与3BM细胞周期调控的信号通路。结果1.对GBM患者肿瘤组织以及正常脑组织进行比较,采用westem blot和RT-PCR检测USP22表达水平。结果显示GBM组织中USP22表达水平较正常对照组明显增高。2.原代培养的GBM细胞在含10%胎牛血清的DMEM培养基中贴壁生长,状态良好,免疫荧光显示细胞内GFAP高表达。3.设计合成的三对USP22-specific siRNA(siRNA-1、siRNA-2、siRNA-3)分别转染原代细胞后,细胞中USP22表达均下降,其中siRNA-3干扰效果明显。使用筛选出的siRNA-3转染原代培养胶质母细胞瘤细胞,设置转染control-siRNA的细胞为阴性对照组,MTT法检测细胞活性,结果表明在转染USP22-specific siRNA后,肿瘤细胞的增殖被明显抑制,48小时、72小时和96小时三个时间点对应的细胞存活率分别为(65.1±4.3)%,(53.5±5.2)%和(47.2±4.3)%。而阴性对照组转染control siRNA后对肿瘤细胞的增殖没有明显的抑制作用。从48小时起,两组的细胞活性存在明显差异。4.转染USP22-specific siRNA不能明显增加GBM早期凋亡,提示在GBM中USP22通路可能不是调控其凋亡能力的主要信号通路。5. USP22-specific siRNA作用48小时可以明显增加G0/G1期细胞比例,这提示USP22-specific siRNA主要通过诱导G1/S期的周期阻滞和增加细胞死亡来减少GBM增殖。6.体外实验中转染USP22-specific siRNA后,p53、p21和cyclin E的表达水平较对照组未发生改变,参与GBM细胞周期调控的信号通路复杂,具体机制有待进一步研究。结论1.胶质母细胞瘤组织中USP22表达在蛋白水平和mRNA水平均较正常脑组织明显增高。2.使用酶消化法可获得生长良好的原代培养胶质母细胞瘤细胞,细胞免疫荧光GFPA阳性。3.成功筛选沉默USP22基因的小RNA干扰序列,有效降低了胶质母细胞瘤细胞中USP22表达,为进一步研究奠定基础。4.体外实验中转染USP22-specific siRNA后,肿瘤细胞的细胞活性降低。这种作用主要通过引起GBM细胞G1/S期周期阻滞来实现。5.抑制USP22不能引起GBM细胞凋亡