背景肺癌是我国发病率最高的恶性肿瘤,占恶性肿瘤死亡原因的第一位。目前,我国每年新发肺癌约50万,到2025年预计每年将有100万新发肺癌患者,近30年来,我国肺癌死亡率上升了 465%,严重威胁着人民群众的健康和生命。非小细胞肺癌(non-small celllung cancer,NSCLC)是肺癌的主要病理类型,约占肺癌的85%～90%。与小细胞肺癌相比,NSCLC的生长较为缓慢,转移较晚,但诊断时可手术切除的病例仅占15～18%,术后发生转移或复发的机率很高,以顺铂为基础的双药联合化疗的缓解率仅30%左右,化疗在改善晚期NSCLC患者的生存期方面的作用十分有限。因此整体而言,NSCLC病人的预后不佳。随着对肺癌分子分型的研究进展,NSCLC的治疗已迈入精准医疗时代,表皮生长因子受体(epithelial growth factor receptor,EGFR)是其中研究最广泛并已广泛应用到临床的靶向基因之一·。在NSCLC患者中,EGFR突变主要发生在胞内段编码结构域(外显子18-21),包括外显子19的缺失突变(delE746-A750)和外显子21的点突变(L858R),这些突变使NSCLC对表皮生长因子受体-酪氨酸激酶抑制剂(epithelial growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitor,EGFR-TKI)的敏感性增加,称作增敏EGFR突变,占所有EGFR突变的90%以上,高达50%的亚洲NSCLC患者中发现这些增敏EGFR突变。EGFR-TKI使晚期NSCLC的治疗从标准含铂双药的化疗时代进入靶向治疗时代,以吉非替尼和厄洛替尼为代表的第一代EGFR-TKI已成为EGFR敏感突变阳性患者的一线首选治疗药物。多个大规模的临床试验已证明EGFR敏感突变阳性患者可从EGFR-TKI一线治疗中获益,然而耐药问题始终如影随形,多数存在增敏EGFR突变的NSCLC患者在约8～16个月治疗后对吉非替尼产生耐药性,对于EGFR-TKI耐药机制的探索已成为国内外研究的热点。NSCLC对EGFR-TKI的分子耐药机制包括EGFR20外显子T790M突变、MET基因扩增、上皮间质转化(epithelial-mesenchymaltransition,EMT)、向小细胞肺癌转化和 EGFR 通路的旁路激活等,其中以20外显子T790M突变最为常见。肺癌耐药的另一种机制是获得肿瘤干细胞(cancer stem cell,CSC)表型,通过多能性转录因子(如Oct4,Sox2和Nanog)的表达介导。CSC,又称肿瘤干细胞、癌干细胞,是指具有干细胞特性的小部分癌细胞,即具有"自我复制"以及"多向分化"能力的癌细胞。CSC被认为是肿瘤克隆的发生核心,代表驱动肿瘤生长和进展的细胞群体,它是肿瘤发生、发展、侵袭转移和耐药复发的根源。多项研究表明肺癌中具有高致瘤性、多潜能、可自我更新、高耐药的CSC的存在。八聚体结合转录因子 4(octamer-binding transcription factor 4,Oct4)是胚胎干细胞维持自我更新及分化潜能的最重要的转录因子,也是胚胎干细胞的标志物。Oct4在人体多种实体肿瘤中呈过表达,并参与肿瘤的发生、发展,复发和转移。Oct4高表达患者的疾病进展快、易转移并预后差。使用人非小细胞肺腺癌细胞系和患者的原发性肺癌细胞发现,尽管CSC有不同的表型,但其均表达多潜能干细胞基因,尤其是Oct4,Sox2和Nanog,可以作为CSC的标志物。Oct4与肿瘤干细胞的多药耐药(multidrug resistance,MDR)表型相关,在恶性肿瘤化疗耐药的发生和发展过程中发挥重要作用,这使Oct4可能成为癌症治疗的重要靶标,特别是针对具有化疗抗性的肿瘤类型,然而,很少有研究涉及Oct4在肿瘤靶向药物的耐药过程中所起的作用。有研究发现,转基因CCSP-rtTA/TetO-EGFR(L858R/T790M)诱导EGFR突变吉非替尼耐药的小鼠肺组织中Oct4和Sox2表达增加。然而,调节CSC在吉非替尼耐药性中的分子机制尚未完全澄清。信号传导及转录激活子3(signal transducer and ac-tivator oftranscription3,STAT3)是高度保守的转录因子家族成员之一,正常情况下参与细胞周期和细胞凋亡的调控,在恶性肿瘤中也与肿瘤的侵袭转移、肿瘤血管的发生及肿瘤细胞的免疫逃逸等有关,并通过调节干细胞相关转录因子的表达参与维持干细胞表型和多能性。Survivin是凋亡抑制蛋白家族中的重要成员,survivin基因启动子上含有STAT3的结合位点。STAT3途径也参与肺癌的发生,STAT3的激活是NSCLC对EGFR-TKI耐药的内在机制,Oct4是否在STAT3/survivin信号途径中发挥作用尚少研究。对Oct4在NSCLC中的表达及其对吉非替尼耐药性影响的相关机制进行研究能够更好的阐明肺癌耐药的发生和发展机制,从而采取针对性的治疗策略以期进一步提高EGFR突变肺癌患者的靶向药物治疗的有效率和持久性。目的探讨Oct4 mRNA和蛋白在NSCLC患者肿瘤组织的表达及其与患者临床病理特征的相关性,应用Oct4-siRNA转染构建特异性沉默Oct4基因表达的PC-9和PC-9/GR细胞系,探讨Oct4在NSCLC中对肿瘤细胞增殖和吉非替尼获得性耐药的作用及其可能的信号通路。方法(1)Oct4在非小细胞肺癌组织中的表达及意义86例NSCLC患者肺癌组织样本(NSCLC组)及其相应癌旁正常组织样本(对照组)。采用荧光定量PCR法、免疫组化法以及western blot法分别检测上述组织样本中Oct4 mRNA和蛋白的表达,分析其表达与患者临床病理特征包括年龄、性别、吸烟指数、肿块大小、分化程度、TNM分期及病理类型等的相关性。(2)Oct4在非小细胞肺癌增殖及对吉非替尼耐药中的作用选择含有EGFR外显子19缺失突变的人肺癌细胞系PC-9及吉非替尼获得性耐药的细胞系PC-9/GR作为研究对象,采用荧光定量PCR法和western blot法分别检测PC-9细胞和PC-9/GR细胞中Oct4 mRNA和蛋白的表达。应用Oct4-siRNA转染构建特异性沉默Oct4基因表达的PC-9和PC-9/GR细胞系,分为四组:Con-siRNAPC-9 细胞组(转染 Con-siRNA)、Oct4-siRNAPC-9 细胞组(转染 Oct4-siRNA)、Con-siRNAPC-9/GR 细胞组(转染 Con-siRNA)和Oct4-siRNA PC-9/GR 细胞组(转染 Oct4-siRNA)。Western blot 法检测抑制Oct4基因表达后人肺癌PC-9细胞和PC-9/GR细胞中Oct4蛋白的表达情况,MTT法检测PC-9细胞和PC-9/GR细胞在转染后24h、48h和72h时的增殖活性。然后将PC-9和PC-9/G R细胞各分为4组:Con-siRNA组(转染Con-si RN A)、Con-siRNA+Gefitnib 组(2.5μM 吉非替尼 + 转染 Con-siRNA)、Oct4-siRNA组(转染 Oct4-siRNA)和 Oct4-siRNA+Gefitnib 组(2.5μM 吉非替尼 + 转染Oct4-siRNA),采用流式细胞术检测上述各组细胞的凋亡率。(3)OCT4对非小细胞肺癌吉非替尼耐药的机制研究Western blot 法检测 PC-9 细胞和 PC-9/GR 细胞中 P-STAT3 和 survivin 蛋白的表达,免疫荧光检测Oct4和p-STAT3蛋白在PC-9细胞和PC-9/GR细胞的表达。应用Oct4-siRNA转染构建特异性沉默Oct4基因表达的PC-9和PC-9/GR细胞系,分为四组:Con-siRNA PC-9细胞组(转染Con-siRNA)、Oct4-siRNA PC-9 细胞组(转染 Oct4-siRNA)、Con-siRNA PC-9/GR 细胞组(转染 Con-siRNA)和 Oct4-siRNAPC-9/GR 细胞组(转染 Oct4-siRNA),采用荧光定量PCR法及western blot法分别检测上述四组Oct4,p-STAT3和survivin mRNA和蛋白的表达。结果(1)Oct4在非小细胞肺癌组织中的表达及意义荧光定量PCR检测结果表明,NSCLC组中Oct4 mRNA的表达量明显高于对照组(t= 3.566,P= 0.008)。Western blot法检测结果表明,NSCLC组中Oct4蛋白的表达量明显高于对照组(t=3.764,P = 0.007)。免疫组化检测结果表明,Oct4蛋白染色阳性呈棕黄色颗粒状;与对照组相比,NSCLC组Oct4蛋白的阳性细胞百分比明显增高(t= 8.033,P<0.001)。Oct4的表达在患者的性别、年龄、吸烟指数和肿块大小等方面无统计学差异(P>0.05),而与患者的病理类型,分化程度和TNM分期有关,在腺癌、分化程度低和TNM Ⅲ期的患者中Oct4表达明显增加(P<0.05)。(2)Oct4在非小细胞肺癌增殖及对吉非替尼耐药中的作用与 PC-9 细胞相比,PC-9/GR 细胞中 Oct4 mRNA(t = 4.21,P = 0.006)和Oct4蛋白(t = 4.233,P = 0.005)的表达量均明显增高。在PC-9细胞中,Oct4-siRNA组Oct4蛋白的表达量明显低于Con-siRNA组(t = 3.985,P =0.009)。在PC-9/GR细胞中,Oct4-siRNA组Oct4蛋白的表达量明显低于Con-siRNA 组(t = 4.117,P = 0.007)。在 PC-9 和 PC-9/GR 细胞中,转染后24h、48h和72h时Oct4-siRNA组增殖活性均明显低于Con-siRNA组(P<0.05)。在PC-9细胞中,与Con-siRNA组相比,Con-siRNA + Gefitnib组的细胞凋亡率明显增高(X 2= 8.644,P = 0.003);与 Oct4-siRNA 组相比,Oct4-siRNA +Gefitnib组的细胞凋亡率明显增高(X2=9.019,P= 0.002)。在PC-9/GR细胞中,与Con-siRNA组相比,Con-siRNA + Gefitnib组的细胞凋亡率无统计学差异(X2 =1.413,P= 0.872);与 Oct4-siRNA组相比,Oct4-siRNA+Gefitnib组的细胞凋亡率明显增高(X2= 8.798,P=0.004)。(3)OCT4对非小细胞肺癌吉非替尼耐药的机制研究与PC-9细胞相比,PC-9/GR细胞中磷酸化STAT3(p-STAT3)蛋白的表达量明显增高(t = 4.197,P=0.004);与PC-9细胞相比,PC-9/GR细胞中survivin蛋白的表达量明显增高(t= 3.639,P= 0.008)。免疫荧光检测结果表明,Oct4与p-STAT3蛋白在PC-9细胞和PC-9/GR细胞均表达于细胞核,而两者在PC-9/GR细胞中的表达水平较PC-9细胞明显提高。荧光定量PCR检测结果发现,在 PC-9 细胞,Oct4-siRNA 组 Oct4、p-STAT3 和 survivin mRNA 的表达量与 Con-siRNA 组相比均明显减少(t= 2.934,3.024,3.216,P=0.037,0.031,0.025);在 PC-9/GR 细胞,Oct4-siRNA 组 Oct4、p-STAT3 和 survivin mRNA的表达量与Con-siRNA组相比均明显减少(t= 3.108,2.014,2.572,P =0.009,0.028,0.017)。Western blot 法检测结果发现,在 PC-9 细胞,Oct4-siRNA 组 Oct4、p-STAT3 和 survivin 蛋白的表达量与 Con-siRNA 组相比均明显减少(t =2.889,2.985,2.917,P= 0.018,0.007,0.013);在 PC-9/GR细胞,Oct4-siRNA 组 Oct4、p-STAT3 和 survivin 蛋白的表达量与 Con-siRNA组相比均明显减少(= 3.737,3.756,3.011,P= 0.002,0.002,0.007)。结论(1)Oct4在NSCLC组织中的表达增加;Oct4高表达与NSCLC的低分化、TNM分期高及病理分型有关,Oct4高表达可作为NSCLC预后差的一个判断指标。(2)Oct4与NSCLC细胞对吉非替尼的耐药性有关。特异性沉默Oct4基因表达能够逆转NSCLC细胞对吉非替尼的的耐药性并促进细胞凋亡。(3)p-STAT3/survivin信号通路可能与NSCLC细胞对吉非替尼的的获得性耐药有关。Oct4的下调可以逆转NSCLC细胞对吉非替尼的的获得性耐药,其机制可能与p-STAT3/survivin信号通路有关。创新性及意义本研究发现Oct4在维持肺腺癌细胞PC-9/GR对吉非替尼的耐药性方面具有重要作用,选择性抑制Oct4表达可以逆转PC-9/GR对吉非替尼的耐药性,并首次提出Oct4在肺癌细胞对吉非替尼耐药性的调节机制可能是通过STAT3/survivin信号通路来实现的。通过对NSCLC吉非替尼耐药机制的进一步了解,可以为临床上开辟新的NSCLC靶向治疗手段奠定基础。