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在哺乳动物听觉系统中,感觉神经终末细胞—耳蜗毛细胞,它能够将声刺激转换成电信号,并通过听觉神经传导至中枢,以便维持正常的听力。过度声刺激、老化、耳毒性药物(如氨基糖苷类抗生素、抗疟药、抗肿瘤药、袢利尿剂等)、感染(如风疹、流行性脑膜炎、流行性腮腺炎等)及自身免疫性疾病等多种因素均可引发耳蜗毛细胞的不可逆性损伤,从而导致永久性的感音神经性耳聋。目前对于感音神经性耳聋的治疗,主要利用放大设备(助听器)和电刺激听觉神经元的设备(耳蜗植入),但目前这两种临床治疗方法受到多种因素,如患者的耳聋程度、病程、年龄、受教育程度等多方面的影响,并且,即使使用助听器或耳蜗植入后,仍有部分患者不能改善听力,现在需要一种新的治疗方法用于临床,为更多的耳聋患者服务。运用促使非感觉上皮细胞向毛细胞分化的关键基因,是重建耳蜗Corti’s结构,恢复听功能的可行方法。近20年,已有报道关于Mathl对正常体外培养基底膜使毛细胞增多的结果,但是,对于耳毒性药物损伤后的离体培养的耳蜗基底膜,导入Mathl后毛细胞的变化情况,目前还没有相关研究。本研究利用腺病毒载体将诱导毛细胞分化的关键基因---Math1导入到药物性损伤后离体培养的基底膜中,利用免疫组织化学染色、计数单位长度毛细胞等的方法,观察毛细胞数量的变化,研究分以下两个部分。第一部分新生大鼠耳蜗毛细胞损害离体动物模型的建立本部分研究的目的是建立耳毒性药物损伤离体动物模型,用于耳蜗毛细胞再生的离体实验研究。选取出生后0天(PO)的健康SD大鼠,在超净台内,在放大倍数为20-40倍的体视学显微镜下,用游丝镊完整剥取整个耳蜗基底膜,然后将其按照本身的螺旋方式平铺于六孔板中,加入含有5%胎牛血清的DMEM培养基,在含有5%CO2培养箱中进行培养,培养12小时后,可见整齐排列的一排内毛细胞和三排外毛细胞。实验可分为对照组和3个实验组,将不同浓度硫酸新霉素(1mmol/L,2mmol/L, 4mmol/L)分别加入正常培养12小时的基底膜中,继续培养24小时后,终止实验,然后进行MyosinⅦa免疫组织化学染色,在共聚焦显微镜下观察各回毛细胞缺失情况,并分别选取10个图片进行毛细胞计数(100μm),利用CHISS软件进行统计分析。加入硫酸新霉素后,耳蜗毛细胞损伤从底回外毛细胞开始,随着药物浓度增加,逐渐累及到中回,最后顶回受累,以外毛细胞为甚。以上结果说明,体外培养的耳蜗毛细胞随着硫酸新霉素药物浓度的增加损失越严重,且从底回向顶回发展,此与活体动物实验的损害规律基本相同,因此可作为耳毒性损伤后毛细胞再生研究的离体动物模型。第二部分腺病毒携带Math1基因转染损伤后新生大鼠耳蜗的实验观察本部分的研究目的是观察Math1基因对离体培养药物性损伤后耳蜗毛细胞的影响。在第一部分的基础上,对耳毒性药物损伤后耳蜗毛细胞再生做初步的研究。选取40个耳蜗基底膜,随机分为4组:正常对照组、硫酸新霉素处理组、硫酸新霉素处理+ad-Math1-EGFP组和硫酸新霉素处理+ad-EGFP组,每组10个耳蜗。Mathl基因成功转染后,利用MyosinⅦa免疫组织化学染色观察耳蜗毛细胞变化。结果显示:硫酸新霉素处理+ad-Math1-EGFP组在Math1基因成功转染后10天,除螺旋神经节部位有绿色荧光表达外,在受损毛细胞区域的支持细胞也有绿色荧光表达,而正常对照组、硫酸新霉素处理组、硫酸新霉素处理+ad-EGFP组,在毛细胞区域几乎无绿色荧光表达。说明,Math1基因可以转染受损毛细胞区域的支持细胞,提示该区域的支持细胞可以向耳蜗毛细胞转化。