骨组织的变化在很大程度上是由两种骨细胞联合作用的,即成骨细胞和破骨细胞。成骨细胞是主要负责新骨形成,而破骨细胞则负责清除骨化组织。他们的形成和活动受到多种激素和细胞因子的严格控制。干扰这些细胞能形成许多病理骨状况。特别是在成人骨骼疾病中,如骨关节炎,类风湿性关节炎,破骨细胞活动异常。促炎分泌物如TNF-α、IL-6产生于病理骨组织中,并逐渐调节破骨细胞活动,促进疾病发展,因此靶向抑制这些促炎症分泌物的对于疾病的治疗至关重要。最近的研究进展显示了肿瘤坏死因子受体(TNFR)/TNF样蛋白质的重要性:骨保护素(OPG),核因子激活受体(RANK)和RANK配体(RANKL)共同调控破骨细胞功能。目前的研究表明RANKL或TNF-α联合巨噬细胞集落刺激因子(MCSF)能从骨髓巨噬细胞体外引起破骨细胞生成,但机制不完全清楚。所以,进一步阐明RANKL或TNF-α信号通路生理和病理的调整,对于骨溶解的临床干预治疗具有重要的意义。整合蛋白是介导细胞和细胞及细胞和基质间相互作用的异二聚体受体,他们在破骨细胞分化和活化中起到重要作用。破骨细胞的表达的整合蛋白经分析确定至少有三种主要的集成类型——α5β3,α5β1,α2β1。尽管α5β3整合蛋白在破骨细胞生成中有至关重要的作用,其他的类型仍然未知。但考虑到大部分都涉及到整合蛋白β1,通过整合蛋白β1可以分析其他亚类型和整合蛋白β1参与破骨细胞分化的作用。α肿瘤坏死因子(TNF-α)是一种主要由巨噬细胞和单核细胞产生的促炎细胞因子,并参与正常炎症反应和免疫反应。α肿瘤坏死因子在许多病理状态下产生增多,包括败血症、恶性肿瘤、心脏衰竭和慢性炎性疾病。在重症类风湿关节炎患者的血液及关节中都可发现肿瘤坏死因子增多。在本研究中TNF-α具有诱导破骨细胞分化的重要作用。而研究中另外一种具有诱导破骨细胞分化的重要作用的因子为 RANKL,RANKL 全称为 Receptor Activator for Nuclear Factor-K B Ligand(核因子κ B受体活化因子配体),又名为TNF-related activation-induced cytokine(TRANCE),TNF 相关激活诱导细胞因子;osteoprotegerin ligand(OPGL),骨保护素配体osteoclast differentiation factor(ODF),破骨细胞分化因子。为避免不同命名在学术上引起不便,美国骨矿研究学会(ASBMR)将其标准化命名为RANKL。其在成骨细胞中表达(osteoblast),激活破骨细胞。RANKL过表达,可导致一系列骨疾病,如风湿性关节炎,银屑病性关节炎等相关疾病。虽然RANKL和TNF α诱导破骨细胞分化的作用是已知的,但是其具体的作用机制还不完全清楚,尤其是TNF α的机制,报道很少。TNF α诱导破骨细胞生成的下游信号传导通路没有一致的研究结论。然而,我们越来越多的证据证实了在TNF α作用时和整合素β1作用密切相关。因此,本项目拟研究整合素β1在细胞因子诱导的破骨细胞分化中的作用及其机制。我们首先构建了整合素β1沉默表达细胞系,用RNA干扰技术进行整合素β1的基因敲除,成功构建了所需要的细胞系。然后通过这种细胞系,探索整合素β1是对破骨细胞分化是否具有作用。我们用两种诱导剂诱导破骨细胞分化,分别为RANKL和TNF-α。在两种诱导剂处理组中,结果明显不同。在TNF-α诱导破骨细胞生成中,稳定的敲除整合素β1后,TRAP阳性破骨细胞数量明显减少,而RANKL处理组中,TRAP阳性破骨细胞数量没有显著变化。为了进一步验证结果,我们做了破骨细胞陷窝形成实验,实验结果和TRAP阳性检测结果类似,TNF-α诱导后,整合素β1敲除组陷窝形成显著下降,RANKL处理后,未见显著变换。最后,我们对破骨细胞分化的标志性基因Cathespin κ和Osterix进行检测,结果显示,同样的,在TNF-α诱导后,整合素β1敲除组中Cathespinκ和Osterix的表达都显著降低,而RANKL处理后,两种基因的表达未发现显著变化。以上结果表明,在TNF-α诱导破骨细胞分化的过程中,整合素β1起着重要的作用,它可以促进这一分化过程,而在RANKL诱导破骨细胞分化的过程中,整合素β1则没有这一作用。为了阐明整合素β1在破骨细胞分化中的分子机制,我们进一步研究与破骨细胞分化有关的信号通路的变化,我们选择了三种信号通路,NF-κB信号通路、MAPK信号通路、JNK信号通路。分别应用RANKL,TNF-α作用于细胞,检测两种因子作用下对照组与整合素β1敲除组之间NF-κB、MAPK以及JNK三种信号通路中关键因子的变化。在TNF-α作用的反应中,整合素β1敲除组MAPK信号通路关键因子p38激酶磷酸化明显减少,而NF-KB和JNK信号通路中的关键因子均没有显著变化。相比之下,在RANKL作用下,对照组和整合素β1敲除组NF-κB、MAPK以及JNK三种信号通路中各关键因子均没有发生显著变化。这一结果提示我们,在TNF-α诱导的破骨细胞分化中,整合素β1的作用可能与MAPK信号通路有一定关系。为了进一步验证我们的实验结论,我们用MAPK抑制剂作用于β1敲除组细胞,仍然分别用RANKL和TNF-α进行诱导处理,结果发现,抑制MAKP后,只在TNF-α处理的β1敲除组中观察到破骨细胞分化显著降低。令人惊讶的是,尽管在RANKL处理中我们也增加了 MAPK抑制剂,但是没有显示破骨细胞分化显著减少。通过推测,这意味着与TNF-α诱导破骨细胞的形成相比,MAPK信号通路在RANKL诱导的破骨细胞中的作用很小。而以上结果也进一步证实了,在TNF-α诱导的破骨细胞分化中,整合素β1的作用与MAPK信号通路有关。最后,我们又应用了整合素β1抑制剂进行作用,分为空白对照组,2.5μg/mL组和5.(0μg/mL组,结果显示,在RANKL处理中,破骨细胞分化数量没有显著变化,而在TNF-α处理时,整合素β1抑制剂组破骨细胞分化数量显著下降,而且5.0μg/mL组比2.5μg/mL组破骨细胞数量下降更加显著。这一结果进一步证明了整合素β1在TNF-α诱导的破骨细胞分化过程中起着重要的促进作用,而且提示我们这种促进作用和整合素β31的含量呈现一个正相关。同样,我们用MAPK激酶抑制剂做相同的实验,结果整合素β1抑制剂实验结果类似,在RANKL处理中,破骨细胞分化数量没有显著变化,而在TNF-α处理时,整合素β1抑制剂组破骨细胞分化数量显著下降,而且5.0μg/mL组比2.5μg/mL组破骨细胞数量下降更加显著。这也进一步说明了 MAPK信号通路在TNF-α在诱导破骨细胞分化的过程中起着重要作用,抑制此通路可以减少破骨细胞分化。总之,我们的研究结果表明,整合素β1可促进破骨细胞分化,而且是在TNF-α诱导破骨细胞形成中起着重要作用,并且这一作用可能是通过MAPK信号通路来实现的。这一研究结果可以为进一步寻找治疗相关疾病的靶向药物提供理论支持和实验基础。