论文部分内容阅读
目的1、探索SIRT1与硼替佐米诱导的多发性骨髓瘤耐药的相关性。2、研究SIRT1通过hedgehog信号通路促进多发性骨髓瘤耐药性产生的机制。3、评估靶向SIRT1对逆转骨髓瘤耐药和骨破坏的效果。方法用小剂量持续诱导的方法建立硼替佐米耐药(BR)MM细胞系;用RNA测序的方法,筛选耐药细胞系中表达差异的基因;使用CD138+磁珠在初发和复发的MM病人中分离浆细胞,并且检测其SIRT1的表达水平;使用皮尔森相关性分析SIRT1表达水平与MM患者预后的相关性;通过Western blot、蛋白免疫共沉淀以及PLA技术检测SIRT1与GLI2蛋白之间的相互作用;免疫组织化学染色检测SIRT1蛋白在MM患者骨组织标本中的表达水平;染色质免疫共沉淀技术检测GLI2对SIRT1启动子区域的结合,并通过荧光素酶报告基因方法检测基因转录活性的改性;使用CCK8和流式细胞技术检测细胞的活性或者细胞凋亡的比率;通过NOD/SCID小鼠建立皮下移植瘤模型和骨髓腔内注射MM细胞模型,进一步验证SIRT1抑制剂EX527协同BTZ抗MM的效果。结果1、建立两种BTZ耐药的MM细胞系,通过RNA-seq筛选了286个显著上调的基因和75个明显下调的基因,发现SIRT1作为上调最为显著的基因之一。Western blot显示在诱导BTZ耐药MM细胞系的过程中SIRT1蛋白表达水平随着BTZ浓度的升高而逐渐升高。IHC染色,发现复发MM患者中SIRT1的表达显著高。以上研究结果表明,SIRT1与蛋白酶体抑制剂相关,蛋白酶体抑制剂能够诱导MM细胞耐药。2、BTZ联合表观遗传小分子抑制剂库(包含182种化合物)处理MM细胞系通过相对细胞存活进行筛选,发现SIRT1特异性抑制剂S1541(EX527,Selisistat)和S2804(Sirtinol)具有更加明显的协同BTZ抗MM的作用。Western blot检测结果表明SIRT1表达高低与细胞对BTZ的敏感性呈负相关性。以上结果共同说明了SIRT1在介导BTZ耐药的MM中发挥着非常重要的作用。3、RNA-seq数据显示SIRT1和hedgehog信号通路某些靶基因具有明显的相关性。Luciferase实验表明,GLI的转录活性对SIRT1呈现剂量相关性。免疫荧光染色结果显示,过表达SIRT1后,GLI2主要转位到细胞核里,而敲低SIRT1后,GLI2的表达集中在胞浆里面。以上结果表明,SIRT1有可能通过介导关键转录因子GLI2调控Hh信号通路的激活。4、免疫共沉淀检测,发现SIRT1与GLI2蛋白具有相互作用。通过PLA实验进一步验证了SIRT1和GLI2之间的交流。在MM细胞系中通过内源性免疫共沉淀验证了SIRT1和GLI2之间具有直接的相互作用。免疫组织化学染色,检测在相同的MM患者的骨髓切片中SIRT1和GLI2的表达具有共定位和表达同高同低的特点。5、免疫共沉淀实验表明GLI2被组成的乙酰化修饰。Pull-down结果表明,过表达SIRT1明显减弱了GLI2的泛素化修饰,过表达p300明显增强了GLI2的泛素化状态。在细胞内过表达GLI2,通过免疫共沉淀,发现GLI2能够与SIRT1蛋白发生相互作用,且SIRT1能够去乙酰化修饰GLI2。6、Luciferase实验表明SIRT1的转录活性被GLI2蛋白逐渐激活。通过ChIP-qPCR,我们发现GLI2大量的富集在SIRT1的启动子区域。qPCR和Western blot检测表明SIRT1的mRNA水平和蛋白水平伴随GLI2表达增高而增高。以上实验表明SIRT1-GLI2-Hh信号通路-SIRT1调控环的存在,SIRT1的上调引起Hh信号通路的激活从而加强GLI2转录活性。7、使用NOD/SCID小鼠建立xenograft和intrabone模型,结果显示BTZ和EX527联合用药组肿瘤的生长相比较单独用药组和对照组明显得到抑制,且总体生存率显著延长,同时骨破坏程度和面积显著降低。结论1、SIRT1是一种不依赖于突变但由蛋白酶体抑制剂特异性诱导产生的在多发性骨髓瘤耐药性研究中发挥重要作用的关键调节因子。2、SIRT1通过与GLI2相互作用,稳定GLI2蛋白,激活Hh信号通路;3、SIRT1是Hh信号通路的直接靶基因,通过形成SIRT1/GLI2/Hedgehog pathway/SIRT1的正向调控通路维持hedgehog的活性;4、在体内与体外实验中,靶向SIRT1能够协同硼替佐米提高多发性骨髓瘤细胞对硼替佐米的敏感性。