论文部分内容阅读
研究目的在临床肿瘤治疗过程中，肿瘤细胞对化疗药物敏感性的下降直至耐药是导致肿瘤复发和转移的重要原因。近年来，虽然铂类药物和紫杉醇的联合应用，使得卵巢癌患者的五年生存率有所升高，但最终不可避免发生的化疗耐药（特别对铂类耐药）成为影响患者的生存期的关键因素。肿瘤耐药的原因仍不太清楚，但增加化疗的敏感性一方面可以减少药物的毒性作用，提高疗效，另一方面可能减少耐药的发生率。本课题通过研究不同浓度的顺铂（DDP）对卵巢癌细胞α2，3-唾液酸转移酶（ST3GalⅢ）表达的影响，以及卵巢癌细胞的不同ST3GalⅢ水平对DDP毒性的耐受作用和凋亡诱导效应的差异，探讨唾液酸转移酶抑制剂(ST3GalⅢ-siRNA)联合DDP是否增强卵巢癌细胞化疗敏感性，为卵巢癌的临床治疗提供新的思路。研究方法1.鉴定不同卵巢癌细胞株ST3GalⅢ表达水平的差异：用qRT-PCR检测及比较4个卵巢癌细胞株（OVCAR3、SKOV3、HO8910、HO8910PM），ST3GalⅢ mRNA的表达水平。筛选出ST3GalⅢ高表达细胞株(HO8910PM)及低表达细胞株(SKOV3)用于进一步实验。2.确定DDP对卵巢癌细胞的半数抑制率：MTT法分别检测DDP对卵巢癌ST3GalⅢ高、低表达细胞株(HO8910PM、SKOV3)增殖抑制率的影响，计算IC50值，初步比较不同ST3GalⅢ水平的卵巢癌细胞株对DDP的化疗敏感性。3.确定DDP对低表达ST3GalⅢ卵巢癌细胞的作用浓度和时间：选择低表达ST3GalⅢ的卵巢癌SKOV3细胞，分别通过不同DDP浓度（0μmol/L、1μmol/L、20μmol/L、100μmol/L），不同的作用时间（24h、48h、72h），qRT-PCR检测各组细胞的ST3GalⅢ mRNA表达，探究DDP对卵巢癌细胞ST3GalⅢ的表达的影响，筛选出DDP的最佳作用浓度及最佳作用时间。4.观察siRNA对卵巢癌HO8910PM细胞ST3GalⅢ-mRNA（高表达）的选择性敲减作用：选择高表达ST3GalⅢ的卵巢癌HO8910PM细胞，分别转染ST3GalⅢ-siRNA（序列Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ）48h后，通过qRT-PCR和Western blot评价siRNA对细胞ST3GalⅢ的表达抑制效率，探究ST3GalⅢ-siRNA的有效性并筛选出最有效的序列片段。5.低表达ST3GalⅢ的卵巢癌SKOV3细胞，先后经DDP处理和ST3GalⅢ-siRNA转染，用Western blot法检测不同ST3GalⅢ表达水平的卵巢癌细胞CAS凋亡蛋白caspase8及caspase3表达量的改变，用FACS、TUNEL法等分析细胞凋亡效应的改变，探讨在SKOV3中不同ST3GalⅢ水平对DDP化疗效果的影响。6.高表达ST3GalⅢ的卵巢癌HO8910PM细胞，用siRNA下调其ST3GalⅢ表达后，联合应用DDP，用Western blot法检测不同ST3GalⅢ水平细胞CAS凋亡蛋白caspase8及caspase3表达量的改变，FACS、TUNEL法等分析细胞凋亡效应的改变，探讨在HO8910PM细胞中不同ST3GalⅢ水平对DDP化疗效果的影响。结果1.不同卵巢癌细胞株ST3GalⅢ mRNA的表达有明显差异：通过qRT-PCR检测结果证实ST3GalⅢ mRNA在4个卵巢癌细胞株（OVCAR3、SKOV3、HO8910、HO8910PM）中存在差异表达（P＜0.01）；其中HO8910PM ST3GalⅢ mRNA的表达水平最高，SKOV3的表达水平最低，因此本实验选择HO8910PM、SKOV3两细胞株进行后续实验。2.确定了DDP对SKOV3和HO8910PM细胞增殖抑制的适宜浓度：通过MTT法检测不同浓度DDP作用24h SKOV3和HO8910PM细胞的增殖抑制率，证实SKOV3细胞的增殖抑制率明显比HO8910PM高（P＜0.05），SKOV3的IC50值为69.29±1.46μmol/L，HO8910PM的IC50值为425.77±6.58μmol/L；选择三个DDP浓度1μmol/L、20μmol/L、100μmol/L进行后续实验。3. DDP在低浓度下对ST3GalⅢ的表达有增强诱导作用：通过qRT-PCR检测结果证实ST3GalⅢ对DDP具有一定的剂量和时间依赖性，而1μmol/L DDP作用不同时间可不同程度地上调ST3GalⅢ的表达，以1μmol/L DDP作用48h时，其ST3GalⅢ mRNA表达水平升高更为显著，表达量约为对照组的2.5倍，确定DDP的最佳作用浓度为1μmol/L，最佳作用时间是48h。4. siRNA特异性抑制卵巢癌细胞ST3GalⅢ的表达：经ST3GalⅢ-siRNA转染48h后，siRNA序列Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ处理组的ST3GalⅢ mRNA表达量分别为Control组的14.4%、27.4%、35.2%，均比Control组、Lipo组、NC组、 PC组低，有显著的统计学差异（P＜0.01），其中siRNAⅠ组ST3GalⅢ mRNA表达量最低；Western bolt结果也证实siRNAⅠ能有效抑制ST3GalⅢ蛋白的表达，选择siRNAⅠ序列进行后续转染实验。5.卵巢癌SKOV3细胞经DDP+siRNA处理CAS凋亡蛋白的表达增强，细胞凋亡数量增加：Western bolt检测结果显示，1μmol/L DDP作用48h后（DDP组）ST3GalⅢ的表达上调；先后经DDP处理-siRNA转染的(DDP+siRNA)组ST3GalⅢ的表达被显著下调，而其caspase8、caspase3的表达量也随之升高；其相应的对照组（DDP+Lipo组、DDP+NC组、DDP+Control组）ST3GalⅢ、caspase8、caspase3的表达量无明显增加。同样FACS法和TUNEL法检测也显示（DDP+siRNA）组与其他各组比较，凋亡率显著增加。6.卵巢癌HO8910PM细胞经siRNA+DDP处理CAS凋亡蛋白的表达增强，细胞凋亡数量增加：Western bolt检测结果显示，经1μmol/L DDP作用48h后（DDP组），HO8910PM细胞的ST3GalⅢ未被上调，其caspase8、caspase3的表达量与Control组比较也未见增加，但经siRNA沉默ST3GalⅢ的表达后，再联用DDP（siRNA+DDP组），其caspase8、caspase3的表达量显著增加，而其相应的对照组（siRNA、Lipo+DDP组、NC+DDP组）caspase8、caspase3的表达并未增加。同样FACS法和TUNEL法检测也显示（siRNA+DDP）组与其他各组比较，凋亡率显著增加。结论1.四株卵巢癌细胞（HO8910PM、HO8910、SKOV3、OVCAR3）ST3GalⅢ的表达有显著差异，其中HO8910PM ST3GalⅢ的表达水平最高，SKOV3的表达水平最低。2. ST3GalⅢ的高表达增强卵巢癌细胞对DDP的耐受，细胞增殖抑制率下降。3.适宜浓度（1μmol/L）及适宜时间（24h、48h、72h）作用下DDP可以上调卵巢癌SKOV3细胞ST3GalⅢ的表达，而以1μmol/L DDP作用48h其ST3GalⅢ上调作用更显著。4. ST3GalⅢ-siRNA可以有效下调卵巢癌细胞ST3GalⅢ的表达。5. siRNA下调ST3GalⅢ的表达可以增加DDP对卵巢癌细胞的凋亡诱导作用。6. ST3GalⅢ-siRNA可以通过caspase途径促进卵巢癌细胞对DDP的凋亡效应。7. ST3GalⅢ-siRNA联合DDP作用可以提高卵巢癌细胞对DDP的化疗敏感性。