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目的:本研究探讨老龄小鼠缺血性血管再生过程中CatS介导的Wnt5a/SC35负性调控机制,进一步阐明衰老削弱血管再生的相关分子机制,为防治老年心血管疾病提供实验依据。方法:1、动物实验实验1):老龄小鼠(25-29g,雄性,>24个月龄,n=31)(由日本名古屋大学提供),分为CatS基因敲除组(CatS-/-,n=16)和野生组(CatS+/+,n=15)。腹腔内注射戊巴比妥(60mg/kg)进行麻醉,脱毛并切开左下腹皮肤,结扎股动脉根部及其主要分支后切除股动脉段的方法制作小鼠下肢缺血模型。造模成功后在特定时间点收集血液,腓肠肌和骨髓样本,开展以下实验:(1)通过激光散斑血流成像(LSBFI)测定术前、术后即刻、4天、7天、14天的下肢血流,用同一时间点的缺血侧与非缺血侧的下肢血流灌注比值分析血流恢复情况;(2)应用CD31和Mac-3抗体进行免疫染色,c-Kit和Ki67抗体进行免疫荧光,评价肌肉组织中的毛细血管形成,巨噬细胞浸润和骨髓中的干细胞增殖。(3)应用流式细胞术(FACS)检测骨髓及外周血中的血管内皮祖细胞(EPC),评价EPC的增生动员;(4)使用酶联免疫吸附检测(ELISA)试剂盒测定血浆IL-1β3和TNF-α的水平;(5)应用实时定量荧光PCR检测单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1),Toll样受体-2(TLR-2),TLR-4,基质细胞衍生因子-α(SDF-lα),基质金属蛋白酶-2(MMP-2),MMP-9,MMP-1组织抑制剂(TIMP-1),TIMP-2,CatS 和 CatK 等;(6)应用 Western 印迹分析评估p-Akt、p-mTOR、p-ERK、Wnt5a,SC35 等;(7)明胶酶谱法评估 MMP-2 和MMP-9活性;(8)培养主动脉环,观察微血管管腔形成。实验2):老龄小鼠(25-29g,雄性,>24个月龄,n=28)(由日本名古屋大学提供),分为CatS抑制剂组(CatS-I,n=14)和对照组(CONT,n=14)。从制作下肢缺血模型之日前3天至后14天,每隔1天给予CatS-I组小鼠腹腔内注射CatS抑制剂(CatS-I,5mg/kg,溶解在0.5%羧甲基纤维素钠盐);CONT组在同一时间点,单纯注射同等量0.5%羧甲基纤维素钠盐溶剂。按照“实验1”所提及的项目要求,在特定时间点收集血液,腓肠肌和骨髓用于生物学和形态学分析。2、细胞实验在含氧量正常(5%CO2和95%空气)和缺氧(2%O2,5%CO2和93%N2)条件下,用含有血管内皮生长因子(50ng/mL)和4%胎牛血清(FBS)的EGM-2培养基,将人脐静脉血管内皮细胞(HUVECs)培养、传代。传代培养18-20代,获得衰老细胞。通过基因干扰技术对老化HUVECs的CatS表达基因进行沉默或过表达后,提取细胞进行细胞迁移、侵袭、增殖,微血管形成等实验。结果:1、老龄小鼠CatS缺失对缺血诱导的血管生成的影响LSBFI检测结果表明,与CatS+/+老龄小鼠相比,CatS-/-老龄小鼠在整个观察窗内缺血后肢血流恢复减弱;手术后第14天定量免疫染色分析发现CatS-老龄小鼠缺血肌肉组织中毛细血管密度也明显降低。2、在老化HUVECs和老龄小鼠,CatS的缺失增加了抗血管生成目标Wnt5a/SC35蛋白的表达,降低了促血管生成信号通路的激活1)与CatS+/+老龄小鼠相比,CatS-/-老龄小鼠缺血肌肉中Wnt5a和SC35以及IRS-1和HIF-1α蛋白表达水平增高,而促血管生成相关信号通路蛋白p-mTOR,p-eNOS,p-GSK3α/β,p-ERK1/2 的磷酸化水平及 galactin-3 蛋白表达明显降低。2)在老化HUVECs中siCatS抑制自身基因表达。在给予血管内皮生长因子刺激和缺氧应激环境下,CatS基因沉默降低了 HUVECs的迁移、侵袭、增殖和微血管形成相关的细胞行为。明胶酶谱的定量分析发现,siCatS处理后的HUVECs培养基中的MMP-2明胶酶活性显著降低;定量蛋白印迹分析发现CatS基因沉默导致Wnt5a和SC35蛋白表达增加,而p-mTOR和p-GSK3αα/β3磷酸化水平降低。CatS质粒转染刺激衰老HUVECs的CatS表达,降低Wnt5a和SC35蛋白表达及增加p-mTOR和p-GSK3α/β磷酸化水平,从而改善了老化内皮细胞的迁移、侵袭,增殖和微血管形成等能力。3、CatS-/-在体外抑制微血管形成主动脉环培养试验结果,老龄CatS-/-小鼠微血管管腔形成减少,选择性(CatS-I)或非选择性(E64d)CatS抑制剂亦减少CatS+/+小鼠微血管管腔形成。4、CatS-/-导致缺血诱导的血管生成降低FACS检测结果,缺血后第7天CatS-/-小鼠的BM和PB中CD31+/c-Kit+细胞数量减少,免疫细胞荧光结果表明BM由来CD31+/c-Kit+细胞和CD31+/Ki67-细胞数呈下降趋势,c-Kit+细胞微血管形成的数量也随之减少。5、老龄小鼠缺血性应激状态下CatS活性对炎症反应的影响ELISA检测结果,与对照CatS+/+老龄小鼠相比,CatS-/-老龄小鼠血浆中TNF-α和IL-1β水平降低;定量PCR分析结果表明CatS-/-小鼠缺血肌肉中TLR-2/-4、MCP-1和SDF-1α的mRNA水平降低;与对照小鼠相比,术后第4天缺血性肌肉组织免疫组化染色显示CatS-/小鼠其骨骼肌中巨噬细胞明显减少。6、CatS抑制剂对缺血诱导的血管生成的影响1)与对照小鼠相比,在缺血后第4天,CatS-I增加Wnt5a,SC35和HIF-1α蛋白表达,减少目标蛋白p-mTOR,p-Akt,p-ERK1/2,p-GSK3α/β的磷酸化水平及galactin-3蛋白表达,同时减少了 BM和PB中CD31+/c-Kit+细胞的数量,并抑制BM由来c-Kit+细胞增殖和微血管形成;在缺血后第14天,CatS-I也明显抑制老龄CatS+/+小鼠的血流恢复和毛细血管形成。2)CatS-I不仅抑制血浆TNF-α和IL-1β水平,同时减少了缺血肌肉组织的巨噬细胞浸润;明胶酶谱法定量分析结果显示:与对照小鼠组相比,CatS-I老龄小鼠缺血肌肉中MMP-2和MMP-9活性水平降低;定量PCR结果显示:CatS-I老龄小鼠缺血肌肉中炎症因子(TLR-2,MCP-1和SDF-11α)和MMP-2,MMP-9的mRNA水平均下降。结论:1.CatS的缺失增强了抗血管生成因子Wnt5a/SC35蛋白的表达,减弱了促血管生成信号的激活;2.基因和药物抑制CatS活性,可通过负性调节Wnt5a/SC35激活介导的血管内皮细胞生长信号通路激活,炎症反应和细胞外基质蛋白的分解活性,从而抑制缺血诱导的血管再生。综上,CatS和Wnt5a/SC35可成为治疗老年缺血性心血管疾病的具有前景的新分子靶点。