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2型糖尿病的发病过程中许多细胞外环境因素如高血糖,高游离脂肪酸,炎症性细胞因子,淀粉样物质等均可导致的β细胞损伤并发生凋亡。最近研究表明在糖尿病的发病过程中,糖基化终末产物(Advancedglycationend products, AGEs)通过糖基化终末产物受体(receptor for advanced glycation end products, RAGE)也能够对p细胞造成损伤,可能是导致胰岛p细胞功能衰竭和数量减少的因素之一。机体内血糖水平升高时AGEs生成反应加速在体内积累,并对组织和细胞造成损伤效应。但目前AGEs导致p细胞损伤的具体分子机制还不十分清楚。Tribbles同源蛋白3(Tribbles homolog 3, TRB3)是一种不具有激酶活性,但是可以作为脚手架蛋白样调节因子调节多种信号转导因子,参与调节多条信号转导通路能够发挥广泛的生物学功能。TRB3在胰岛素靶组织表达,通过干扰胰岛素通路参与了外周胰岛素抵抗的发生。此外,TRB3可以被内质网应激诱导凋亡中重要的介导因子C/EBP同源蛋白(C/EBP homology protein, CHOP)诱导表达,并参与促进细胞凋亡,但是其促凋亡作用存在争议。我们以往研究发现,TRB3在胰岛p细胞凋亡中起到重要作用。在高糖、高脂和内质网应激均通过上调TRB3介导胰岛p细胞凋亡。是否TRB3也参与了AGEs引起的胰岛p细胞损伤值得研究。研究目的通过检测糖尿病动物模型体内AGEs水平和胰岛细胞中TRB3的表达情况,以及体外AGEs刺激条件下胰岛p细胞系INS-1细胞中TRB3的表达情况,并通过基因过表达或干扰,研究TRB3对AGEs诱导的INS-1细胞氧化损伤和凋亡的影响,探讨TRB3在AGEs诱导p细胞氧化损伤和凋亡中的作用及机制。研究方法分析TRB3与AGEs水平及细胞凋亡的关系：体内实验：采集糖尿病发病不同阶段(第0月、3月、6月和9月)的GK大鼠血清,应用酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)检测血清中AGEs水平；分离纯化GK大鼠胰岛,应用Caspase-Glo3/7凋亡酶活性检测试剂盒评估胰岛细胞凋亡情况,应用Real-time PCR和‘Western blot检测GK大鼠胰岛细胞RAGE和TRB3表达水平,以初步判断TRB3表达与AGEs水平及胰岛细胞凋亡的相关性。体外实验：采用200 ug/mlAGEs刺激INS-1细胞48 h后,应用CCK-8法检测细胞存活率,应用TUNEL染色及流式细胞仪检测AnnexinV-FITC/PI观察AGEs对INS-1细胞凋亡的影响；应用Real-time PCR和Western blot检测细胞中RAGE、TRB3的表达水平。分析TRB3介导AGEs对INS-1细胞损伤作用的机制：应用Real-time PCR和Western blot检测AGEs处理后INS-1中RAGE、TRB3和NADPH氧化酶4(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase 4, NOX4)的表达水平；应用活性氧(reactive oxygen species, ROS)检测试剂盒评估细胞中ROS水平。采用tet-on系统建立可诱导TRB3过表达的INS-1细胞,采用慢病毒载体介导的shRNA干扰法建立TRB3稳定敲降的INS-1细胞。检测TRB3过表达或敲降对细胞凋亡、NOX4 mRNA或蛋白质表达水平及细胞中ROS水平的影响。分析TRB3对PKC信号通路的影响：采用AGEs刺激INS-1细胞后,应用Western blot检测TRB3敲降对AKT的磷酸化水平、PKC8的核转位及PKCβ2膜转位的影响。采用PKC β2抑制剂LY333531处理INS-1细胞后,评估抑制PKC β2活性对细胞凋亡、细胞中NOX4的表达和ROS水平的影响。结果糖尿病GK大鼠血清AGEs的水平随着糖尿病病程的延长而进行性升高,发病6个月后明显高于Wistar大鼠。此时,GK大鼠胰岛细胞中Caspase 3/7凋亡酶活性增强,RAGE和TRB3的表达水平增高。CCK-8实验结果显示,200 ug/ml的AGEs处理INS-1细胞48h后细胞的存活率为明显低于对照组。同时细胞凋亡水平增高,TUNEL染色阳性细胞在AGEs组明显高于对照组,AnnexinV-FITC/PI的流式细胞术结果也同时显示AGEs组凋亡率为明显高于对照组。细胞内RAGE、TRB3和NOX4的表达水平升高；细胞内ROS含量增加。TRB3过表达后,AGEs诱导的细胞凋亡增加,细胞内ROS的水平均增高。敲降TRB3的表达之后,AGEs诱导的细胞凋亡减少,细胞内NOX4的表达及ROS的水平明显降低。进一步研究发现,伴随着TRB3的表达上调PKCβ2表达水平增高,同时,膜转位增加；敲降TRB3后PKCβ2表达水平下降和膜转位减少。而给予PKC β2特异性抑制剂也能够减少AGEs诱导的细胞凋亡,降低细胞内NOX4的表达和ROS的水平。结论TRB3通过PKC β2通路介导AGEs诱导的p细胞氧化损伤和凋亡。